стр. 1

стр. 2

стр. 3

стр. 4

стр. 5

стр. 6

стр. 7

стр. 8

стр. 9

стр. 10

стр. 11

стр. 12

стр. 13

стр. 14

ДЕРЖАВНИЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТИ ХАРЧОВІ

МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ молочнокислих МИКРООРГАНИЗМОВ

видання офіційне

Стандартинформ

Група Н09

УДК 663 / .665.3.001.4: 006.354

ДЕРЖАВНИЙ

СТАНДАРТ

ПРОДУКТИ ХАРЧОВІ Методи визначення молочнокислих мікроорганізмів

Food products. Methods for determination of the lactic acid bacteria

ГОСТ

10444.11-89

МКС 07.100.30 ОКСТУ 9109

Дата введення 01.01.91

Цей стандарт поширюється на нішеві і кисломолочні продукти, закваски, бактеріальні концентрати та бактеріальні препарати молочнокислих бактерій і встановлює метол визначення життєздатних молочнокислих мікроорганізмів і їх найбільш вірогідного чиста (НВЧ). а також методи визначення в нішевих продуктах (крім кістомолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій) бактерій родів Lactobacillus, Leuconostoc. стрептококів групи N рола Streptococcus. Pediococcus. S. thermophilus і визначення найбільш ймовірного чиста (НВЧ) бактерій рола Lactobacillus.

Метол заснований на висіві певної кількості продукту і (або) його розведень в рідкі або щільних селективні поживні середовища, культивуванні посівів при оптимальних умовах і. при необхідності, визначенні морфологічних і біохімічних властивостей виявлених мікроорганізмів і їх підрахунку.

Метод призначений для:

встановлення відповідності мікробіологічних показників якості харчових і кістоматочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій вимогам нормативно-технічної документації;

встановлення промислової стерильності консервів:

з'ясування причин виникнення дефектів харчових продуктів.

1. ВІДБІР І ПІДГОТОВКА ПРОБ

1.1. Відбір і підготовка проб харчових продуктів, крім кисломолочних, - по ГОСТ 26668. 26669.

Відбір проб кисломолочних продуктів (сухих і рідких), заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій і підготовка їх до аналізу - по ГОСТ 9225 1 2.

1.2. Консерви перевіряють на герметичність - по ГОСТ 8756.18.

Повні консерви, нормальні але зовнішнім виглядом, перед випробуванням термостатируют при 30-37 "С в тарі місткістю до 1 дм 3 включно не менее5сут. В rape місткістю понад 1 дм 3 - не менше 7 суг.

Харчові продукти, в яких нормується кількість молочнокислих мікроорганізмів, термостатування не підлягають.

Розведення продуктів готують на пептонно-сольовому розчині по ГОСТ 26669.

Вихідні розведення продуктів з масовою часткою NaCI більше 5% готують з використанням пептонною води; вихідні розведення рибних і м'ясних продуктів готують з використанням фізіологічного розчину.

ГОСТ Р 53430 - 2009.

2. АПАРАТУРА, МАТЕРІАЛИ І РЕАКТИВИ

Для проведення випробування застосовують апаратуру, матеріали, реактиви але ГОСТ 10444.1. ГОСТ 9225 і зазначені нижче:

ваги лабораторні загального призначення з метрологічними характеристиками згідно з ГОСТ 24104 3. з найбільшою межею зважування до 200 г і межею допустимої похибки ± 2 мг (для зважування реактивів):

ваги лабораторні загального призначення з метрологічними характеристиками але ГОСТ 24104 3. з найбільшою межею зважування до 200 г і межею допустимої похибки ± 15 мг (для зважування продукту);

мікроскоп світловий біологічний з пристосуванням для фазово-контрастного Мікроскопують-вання або інших аналогічних марок: скла покривні по ГОСТ 6672; скла предметні по ГОСТ 9284:

термостат з діапазоном робочих температур від 28-55 3 С. дозволяє підтримувати задану температуру з точністю ± 1 'С; пробки коркові але ГОСТ 5541;

лупа складна кишенькова, що дає збільшення в 4-10 разів по ГОСТ 25706; панкреатин дли бактеріальних і вірусолошческіх препаратів: хлороформ технічний по ГОСТ 20015;

молоко знежирене кислотністю не більше 19 "Т. отримується з коров'ячого молока, заготовляється не нижче 2-го сорту за ГОСТ 13264 4 або молоко сухе знежирене за ГОСТ 10970 5; L-аргінін гідрохлорид; бензидин основний або солянокислий; калію цитрат: карбоксилу мул мілину i це; ь підлогу жовтня; твін-80, натрію ацетат; амонію цитрат;

магнію сульфат (MgS0 4 7Н 2 0);

марганцю сульфат (MnS0 4 2Н 2 0);

марганцю сульфат (MnS0 4 4Н 2 0);

кислота сорбінова:

нігрозин;

3. ПІДГОТОВКА ДО ВИПРОБУВАННЯ

3.1. Приготування розчинів реактивів та індикаторів для випробування харчових продуктів (крім кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій)

3.1.1. Бромкрезоловий пурпурний індикатор, розчин масовою концентрацією 1 г / дм 3: 0.1 г бромкрезолового пурпурного з дотриманням правил асептики переносять, змиваючи стерильною дистильованою водою, в мірний посуд місткістю 100 см 3, доводять об'єм цієї ж водою до мітки. Розчин зберігають не більше 3 міс при кімнатній температурі.

3.1.2. Кальцій вуглекислий, водна суспензія масовою концентрацією 30 г / дм 3: 3 г вуглекислого кальцію, п ростер з ванного по ГОСТ 10444.1. переносять, змиваючи дистильованою водою, в мірний посуд місткістю 100 см 3, доводять об'єм до мітки. Суспензію стерилізують при температурі (12111) 3 С протягом 20 хв. Суспензію зберігають не більше 3 міс при кімнатній температурі.

3.1.3. Карболфуксін. концентрований розчин: 1 г фуксину змішують з 10 см 3 96% -ного етилового спирту і 100 см 3 розчину фенолу масовою концентрацією 50 г / дм 3.

Для приготування робочого розчину карболфуксіна до 10 ем "концентрованого розчину карболфуксіна додають 90 см 3 ДІСП про ванній води.

3.1.4. Крісг & тліческій фіолетовий розчин масовою концентрацією 10 г / дм 3: I г кристалічного фіолетового переносять, змиваючи дистильованою водою, в мірний посуд місткістю 100 см ", обсяг доводять до мітки. Розчин зберігають tic більше 3 міс при кімнатній температурі.

3.1.5. Нігрозину суспензія масової концентрації 100 г / дм ": 10 г нігрозину переносять, змиваючи дистильованою водою, в мірний посуд місткістю 100 см 3. Обсяг доводять до мітки. Іпревают до температури 45-50 * С на водяній бані, потім фільтрують через ватно-марлевий фільтр.

3.1.6. Пептонно-сольовий рас твор готують але ГОСТ 26669.

3.1.7. Пептонную воду готують по ГОСТ 26669.

3.1.8. Сорбінова кислота, шелочной розчин: 1 гсорбіновой кислоти переносять, змиваючи розчином піроокісі натрію з NaOH = 1 моль / дм 3, в мірний посуд місткістю 100 см 3. обсяг доводять до мітки тим же розчином. Отриманий розчин стерилізують методом мембранної фільтрації по ГОСТ 26670.

Допускається готувати розчин сорбінової кислоти без фільтрації з дотриманням правил асептики. при цьому розчин піроокісі натрію готують на стерильній дистильованій воді.

3.1.9. Реактив для визначення цитохромов: 1 г бензидину основного або солянокислого розчиняють в 20 см 3 99.8% -ної крижаної оцтової кислоти, додають 30 см 3 дистильованої води і повільно нагрівають, після охолодження в розчин вносять 50 см "96% -ного етилового спирту. Розчин зберігають в холодильнику протягом 1 міс.

3.1.10. Фізіологічний розчин готують по ГОСТ 10444.1.

3.2. Приготування поживних середовищ для випробування нішевих продуктів (крім кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій)

3.2.1. Середу Блнкфельдта щільну готують по ГОСТ 10444.1.

3.2.2. Середовищ »Блікфелила рідка: в 950 см 3 лист lшрованной води розчиняють 10 г.лактози. 10 г глюкози, 5 г пептона, кип'ятять і фільтрують через паперовий фільтр. До фільтрату додають 20 см 3 дріжджового екстракту. 32 см 3 розчину бром Креза ювого пурпурного по а 3.1.1. встановлюють pi 17.3 ± 0.1. розливають в стерильні пробірки і стерилізують при температурі (117 ± 1) * С протягом 20 хв.

3.2.3. Середа Брігс, в модифікації Шарі:

в 875 см 3 дістншірованной води вносять 15 г пептона. 20 г глюкози. 25 см 3 дріжджового екстракту, 5 г оцтовокислого натрію. 5 г калію фосфорнокислого однозамешенного. 2 г амонію лимонно-кислого. 100 см 3 томатного соку (в розрахунку на те. Що в соку міститься не менше 4.5% розчинних сухих речовин, якщо в томатному соку міститься інша кількість сухих речовин, то роблять перерахунок на вміст сухих речовин 4.5%). 1 см 3 таємниця - 80. 5 см 3 розчину солей (MgS0 4 7Н; 0 -11.5 м MnS0 4 4Н 2 0 - 2.86 г, FeS0 4 7Н 2 0 - 0.68 р дистильована вода до 100 см 3), 15 г агару.

Суміш кип'ятять на слабкому вогні до повного розчинення агару. Встановлюють pH таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 * С (6,510.1). Середовище стерилізують при температурі (115 ± 1) * З в лікування 15 хв.

3.2.4. Середа дріжджова: в 100 см 3 дріжджового екстракту, приготованого по ГОСТ 10444.1. додають 900 см 3 дистильованої води. 10 г простерилізованого але ГОСТ 10444.1 вуглекислого кальцію і 100 г сахарози. Суміш нагрівають до розчинення сахарози, встановлюють pH таким чином. щоб після стерилізації він становив при 25 "С (7,1 ± 0.1). розливають в пробірки але 10 см 3 і стерилізують при температурі< 121 ± 1) ‘С в течение 15 мин.

3.2.5. Середу капустяний агар готують але ГОСТ 10444.1.

3.2.6. Середа МРС рідка: в мірну колбу місткістю 1.0 дм 3 поміщають 10 г пептона. 20 см 3 дріжджового екстракту. 20.0 г глюкози, 1.0 см 3 твін - 80, 2,0 г калію фосфорнокислого двузамещен-ного. 5.0 г натрію ацетату, 2.0 г тріаммонія цитрату, 0,2 г сульфату магнію, 0.05 г сульфату марганцю (MnS0 4 4Н 2 0). доливають до мітки м'ясну воду; розчиняють компоненти нагріванням на водяній бані і встановлюють pH таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 "С (6.210.1). Середовище розливають по 10 см 3 в стерильні пробірки і стерилізують в автоклаві при температурі (12111)" С протягом 15 хв. Пробірки з живильним середовищем зберігають при температурі (411) 'С не більше 30 суг.

3.2.7. Середу МРС а гару поклику іншу готують за рецептурою, зазначеної в п. 3.2.6. з додаванням 15-18 гагара. Після розчинення компонентів середу розливають в стерильні колби і стерилізують в автоклаві при температурі (12111) "С протягом 15 хв. Готове середовище зберігають при температурі (411) * С не більше 30 суг.

При необхідності, для підвищення селективності, після стерилізації до 1 дм 3 агарізо ванній або ж1ікой середовища додають I см 3 лужного розчину сорбінової кислоти але н. 3.1.8.

3.2.8. Середа м'ясо-пептони бульйон з pH 9.6:

і м'ясо-Пентон бульйоні, приготованому з ГОСТ 10444.1. встановлюють pH за допомогою розчинів лугу і кислоти по ГОСТ 10444.1 таким чином, щоб пості стерилізації він становив при 25 "С 9.6. Середовище стерилізують при температурі (121 ± I) * С протягом 20 хв.

3.2.9. Середу м'ясо-пептони бульйон з вмістом хлористого натрію 6.5% готують по ГОСТ

10444.1, але при приготуванні збільшують кількість доданого хлористого натрію до 65 г на 1 дм 3 середовища.

3.2.10. Середовище живильне агар з сахарозою:

100.0 г сахарози, 15,0 г агару додають в 1 дм 3 м'ясо-Нептон бульйону, періодично перемішуючи. суміш нагрівають до кипіння і повного розчинення всіх компонентів.

Середу охолоджують до 45-55 "С і встановлюють pH таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 * С (7.1 ± 0.1).

Середовище розливають в колби і стерилізують протягом 15 хв при температурі (121 ± 1) * С. Після стерилізації і перевірки pH середу добре перемішують і розливають у чашки Петрі, зберігають при температурі (4 ± 1) * С не більше 14 суг.

3.2.11. Середа Редді: основа середовища - в колбу, що містить 500 см 3 дистильованої воли, додають 15.0 г агару і нагрівають на водяній бані до розчинення агару. В ін> тую колбу, що містить 500 см 3 дистильованої води, додають 10.0 г цитрату калію і 15.0 г карбоксил метил цедлю-лози і розчиняють при нагріванні. Вміст обох колб змішують і додають 3,0 г пептона, 25 см 3 дріжджового екстракту. 1.25 г калію (1юс<1юрнокнслого двузамешенною. 5.0 г L-аргинин гидрохлорида. нагревают на водяной бане до полного растворения компонентов, охлаждают до температуры 45-55 "С и устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 "С (6.310.2). Основу среды стерилизуют при температуре < 121 ± 1) "С в течение 15 мин и хранят при температуре (4±1) *С не более 30 суг.

Для приготування живильного середовища до 1 дм 3 розплавленої та охолодженої до 45-55 "С основи додають 5.0 см 3 стерильного знежиреного молока. 100 см 3 суспензії вуглекислого кальцію масовою концентрацією 30 г / дм 3 і 2 см 3 розчину бром крезолоного пурпурний масовою концентрацією I г / дм 3.

3.2.12. Середа Рогоза рідка: в мірну колбу місткістю 1.0 дм 3 завадять 10,0 г пептона.

25.0 см 3 дріжджового екстракту. 20,0 г глюкози. 1.0 см 3 таємниця - 80. 6.0 г калію фосфорнокислого однозамешенного, 2.0 г цитрату амонію, 25.0 г ацетату натрію. 1.32 см 3 крижаної оцтової кислоти, 0.575 г сульфату магнію. 0.12 г сульфату марганцю (MnS0 4 2ГПО), 0.034 г сульфату заліза, доливають до мітки дистильовану воду, розчиняють компоненти ііреваніем на водяній бані і встановлюють pH таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 "С (5.410.1). Середовище розливають по 10 см 3 в стерильні пробірки і стерилізують в автоклаві при температурі (12111) * с протягом 15 хв. пробірки з живильним середовищем зберігають при температурі (411) * с не більше 30 суг.

3.2.13. Середу Рогоза а гару поклику готують за рецептурою, описаної в і. 3.2.12. З додаванням

20.0 г агару. Після розчинення компонентів середу рахліваюг в стерильні колби і стерилізують в автоклаві при температурі (12111) 'С протягом 15 хв. Готове середовище зберігають при температурі (411) 'С не більше 30 суг.

3.2.14. Середу з томатного соку готують але ГОСТ 10444.1.

3.2.15. Середовище для визначення псевдокаталази: в мірну колбу місткістю 1 дм 3 завадять

5.0 пептона. 25 см 3 дріжджового екстракту. 0.5 см 3 твін - 80. 0.1 г (MnS0 4 4Н> 0). 0.5 г глюкози. 15 гагара доливають м'ясо-іеітонним бульйоном до мітки, розчиняють компоненти нагріванням на водяній бані і встановлюють pH таким чином, щоб пості стерилізації він становив при 25 * С (6.910.1). Середовище розливають в пробірки по 5-7 см 3 і стерилізують в автоклаві при температурі (12111) * С протягом 15 хв. Після стерилізації пробірки укладають на похилу поверхню для отримання косяків.

3.2.16. Середа Lee:

основа середовища - в мірну колбу місткістю I дм 3 завадять 10.0 г пептона. 50 см 3 дріжджового екстракту. 5.0 г лактози, 3.0 г вуглекислого кальцію, простерилизуйте ванного по ГОСТ 10444.1, 0.5 г Na 2 HP () 4. 18 г агару, доливають дистильованою водою до мітки, розчиняють компоненти натреваніем на водяній бані і встановлюють pH таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 "С (7.011). Середовище стерилізують в автоклаві при температурі (12111) * С протягом 20 хв і. при необхідності, зберігають при температурі (411) 'С не більше 30 діб.

Для приготу & лення живильного середовища до 1 дм 3 основи додають 20 см 3 стерильного розчину бром крезол ового пурпурного з масовою концентрацією 1 г / дм 3, перемішують і розливають у чашки Петрі. Середу зберігають при температурі (4 ± 1) * С не більше 7 суг.

3.3. Приготування поживних середовищ для випробування кістоматочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій

3.3.1. Приготування паралізованого молока

Натуральне або відновлене знежирене молоко кип'ятять або обробляють текучим паром протягом 20 хв і охолоджують! до температури (45 ± 2) "С. Доводять активну кислотність до pH (7,7 ± 0.1). додаючи водний розчин з масовою часткою NaOH 40%. До 1000 см" молока додають від 0.5 до 1.0 г порошку панкреатину. Потім до молока додають від 5 до 6 см 3 хлороформа.Колбу закривають корковою пробкою і витримують при температурі (4012) * С протягом 18-24 год. Протягом перших 3-5 ч молоко 2-3 рази нремешівают (пробку пості перемішування відкривають для видалення хлороформу).

Потім гідролізований молокофільтрують через паперовий фільтр, розводять дистильованою водою у співвідношенні 1: 1. встановлюють активну кислотність pH (7,110.1). додаючи водний розчин з масовою часткою NaOH 40% і використовують для приготування агару з гідролізованим молоком. У разі зберігання гідролізу ванне малок стерилізують в автоклаві при температурі (121 ± 1) * С протягом 15 хв.

3.3.2. Приготування агару з гідролізованим маток

Гідролізований молоко, см 3 - 1000:

агар, г - 15.

До 1000 см 3 г паралізованого маток додають 15 гагара. Середу нагрівають до повного розплавлення агару і фільтрують через вату, розливають у пробірки або колби і стерилізують в автоклаві при температурі (12111) * С протягом (1011) хв.

3.3.3. Приготування стерильного знежиреного маток

Натуральне або відновлене знежирене малок рахліюют по 10 см 3 в пробірки і стерилізують при температурі (12111) 'С протягом (1011) хв.

4. ПРОВЕДЕННЯ ВИПРОБУВАННЯ

4.1. Проведення випробування харчових продуктів (крім кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій)

4.1.1. Для визначення мікроорганізмів використовують подюговленную пробу продукту або його вихідне розведення.

Для визначення присутності і підрахунку кількості мікроорганізмів на чашках Петрі з проби нішевого продукту або з вихідною розведення готують ряд розведень відповідно до допустимою кількістю мікроорганізмів, зазначених у нормативно-технічної документації на конкретний вид нішевого продукту.

Для підрахунку НВЧ з проби нішевого продукту готують вихідне і ряд десятикратних розведень таким чином, щоб в посівах найбільшого розведення мікроорганізми не були виявлені. Д | я посіву вибирають не менше трьох послідовних розведень. З кожною розведення засівають три паралельні пробірки.

4.1.2. Д1Я посію в рідкі середовища за методом НВЧ і на чашки Петрі глибинним методом відбирають по 1.0 см "підготовленої проби продукту і (або) нею розведення, для посію на чашки Петрі поверхневим методом - по 0.1 -0.2 см 3.

Посіви глибинним або поверхневим методами, а також із застосуванням мембранної фільтрації проводять по ГОСТ 26670.

При застосуванні методу мембранних фільтрів фільтрують обсяг рідкого продукту, який вказаний в нормативно-технічної документації на конкретний ши нішевого продукту.

4.1.3. Для визначення прісугствія або підрахунку НВЧ молочнокислих мікроорганізмів проводять посів на одну з рідких середовищ, зазначених в пі. 3.2.2. 3.2.6 або 3.2.12.

Якщо після внесення продукту в середу Блнкфельата середовище змінилося колір, то в неї додають кілька крапель розчину стерильною шелочі (NaOH або КОН) масовою концентрацією 50 г / дм 3 до відновлення первинного забарвлення.

Для визначення присутності або підрахунку кількості молочнокислих мікроорганізмів допускається замість посіву в рідкі середовища проводити посів глибинним методом в одну з агаріеованних середовищ, зазначених в пп.3.2.1, 3.2.5, 3.2.7, 3.2.13 або 3.2.14.

Для визначення присутності або підрахунку НВЧ бактерій роду Lactobacillus проводять посів на одну з рідких середовищ, зазначених в сб. 3.2.6 або 3.2.12.

Для визначення присутності або підрахунку кількості бактерій роду Lactobacillus замість посіву в рідкі середовища проводять посів глибинним методом в одну з а гару поклику інших середовищ, зазначених в ні. 3.2.7 або 3.2.13.

Для визначення присутності бактерій роду Leuconostoc проводять посів на рідку середу, зазначену в і. 3.2.4.

Для визначення присутності замість використання рідкого середовища, а також для підрахунку кількості бактерій роду Leuconostoc на чашках Петрі або із застосуванням методу мембранної фільтрації проводять посів поверхневим методом на щільних середу, зазначену в і. 3.2.10.

Дш визначення присутності або підрахунку кількості стрептококів фупп N роду Streptococcus проводять посів глибинним методом в щільних середу, зазначену в п. 3.2.11. а для S.thermophilus використовують середу з футболу. 3.2.16.

Для визначення присутності або підрахунку кількості бактерій роду Pediococcus проводять посів глибинним методом в щільних середу, зазначену в п. 3.2.3.

4.1.4. Посіви для визначення присутності або підрахунку кількості молочнокислих мікроорганізмів. бактерій родів Lactobacillus стрептококів групи N роду Streptococcus инкубируют не більше 5 діб при температу ре (30 ± 1) ° С або не більше 3 діб при температурі (37 ± 1) ° С; посіви для визначення присутності або підрахунку кількості бактерій роду Leuconostoc инкубируют не більше 5 діб при температурі (22 ± 1) ° С. Посіви для визначення присутності або підрахунку кількості S.thermophilus инкубируют (48 ± 3) ч при температурі (45 ± 1) ° С. Посіви на чашках Петрі для визначення присутності або підрахунку кількості бактерій роду Leuconostoc инкубируют дном вниз.

Інкубування посівів на рідких середовищах припиняють при співаючи & Тенни видимих ознак

Попередній підрахунок колоній на щільних середовищах проводять через 48 ч.

4.1.5. У посівах на агаріеованних середовищах для визначення присутності або підрахунку кількості молочнокислих мікроорганізмів, бактерій роду Lactobacillus, Pediococcus стрептококів фупп N роду Streptococcus. S.thermophilus. офаніченіе доступу здійснюють згідно з ГОСТ 30425 або одним із зазначених нижче способів:

на застиглу живильне середовище в чашках Петрі наливають другий стій розплавленої та охолодженої до (45 ± I) * З агарізо ванній середовища в кількості 5.0 см 1 і залишають до затвердіння:

чашки Петрі завадять в газове середовище, що складається з 95% N 2 і 5% С0 2:

чашки Петрі поміщають в анаеростатах. Апарат закривають, за допомогою вакуумних насосів створюють вакуум 86.6-93.3 кПа;

в кожну пробірку з рідким середовищем додають стерильний рідкий парафін в кількості, необхідній для отримання стовпа висотою близько 2 см.

4.1.6. Посіви на рідких середовищах щодня просмафівают і відбирають пробірки з видимими ознаками росту. Характер зростання на рідких середовищах наведено в додатку 2. З пробірок з ознаками росту проводять пересів на агарізонаіние середовища (див. П. 4.1.3) бактеріологічною петлею так. щоб отримати зростання ізольованих колоній. Посіви інкубують а й. 4.1.4.

4.1.7. Посіви на щільних середовищах після інкубування переглядають і для підрахунку відбирають чашки Петрі, на яких виросло від 15 до 150 характерних колоній.

При визначенні кількості мікроорганізмів методом мембранних фільтрів допускається проводити відбір чашок Петрі для підрахунку, якщо на фільтрах виросло менше 15 характерних колоній.

Характеристика характерних колоній приведена в додатку 2.

4.1.8. Для підтвердження належності характерних колоній до молочнокислим мікроорганізмам або бактеріям одного з родів Lactobacillus, Leuconostoc. Pediococcus стрептококів фупп N роду Streptococcus. S.thermophilus, відбирають з посівів з футболу. 4.1.7 або 4.1.6 не менше 5 характерних колоній. Належність кожної відібраної колонії до певних мікроорганізмів встановлюють по відношенню до фарбування за Грамом. рухливості, наявності каталази, додатково при ідентифікації бактерій роду Leuconostos визначають наявність капсул, при ідентифікації стреітокок-

287

ков виду S.thermophilus і стрептококів групи N роду Streptococcus - наявність зростання в мясоіептон-ном бульйоні з pH 9,6 і в мясопептонном бульйоні з 6,5% NaCI.

4.1.8.1. Для визначення ставлення мікроорганізмів до фарбування за Грамом з колоній готують мазки, фарбують їх по ГОСТ 30425 і проводять мікроскопію.

4.1.8.2. Для вивчення рухливості мікроорганізмів з колоній готують препарати методом висячої чи роздавленої краплі і проводять мікроскопію. Результати микроскопирования оцінюють згідно з додатком I.

4.1.8.3. Каталазну активність культур визначають за ГОСТ 30425.

Результати визначення каталазной активності оцінюють згідно з додатком 1.

Рахтоженне перекису водню у бактерій рід ;! Pediococcus можливо за рахунок ферменту псевдокаталази. Тому при визначенні молочнокислих мікроорганізмів або бактерій роду Pediococcus в разі, якщо в характерних колоніях виявлено грампозитивні, нерухомі мікроорганізми. гавкаючі позитивну каталазну реакцію, контролюють відсутність цито-хромові шляхом постановки бензидинового тесту. Ди цього виросли на чашках Петрі колонії бактерій 24-48-часово-IX) віку заливають розчином бензидину. зазначеним в п. 3.1.9. Після того, як розчин оживляти колонії, додають в чашку приблизно такий же обсяг 5% -ного перекису водню. Молочнокислі мікроорганізми, в тому числі бактерії роду Pediococcus, не містять цитохромов. У разі присутності цитохромов колонії забарвлюються в блакитно-зелений або яскраво-блакитний колір.

При відсутності бензидина допускається проводити визначення наявності нсепдока Галазов на середовищі п. 3.2.15 з низькою концентрацією глюкози - 0.05%.

Посіви інкубують по п. 4.1.4. визначення ісевдокаталази проводять також як і каталази по ГОСТ 30425.

Культури, що утворюють псевдокаталазу, відносять до роду Pediococcus.

4.1.8.4. При ідентифікації бактерій роду Leuconostoc готують препарати і фарбують їх але Бурі для виявлення бактеріальних капсул. Для цього на добре знежиреному і обпеченому предметному склі змішують краплю бактеріальної культури з дрібним порошком чорної туші або суспензією нігрозину.

За допомогою другою скла зі шліфованими краями швидко готують тонкий мазок, який фіксують, кілька разів проводячи його через полум'я пальника. Мазок дофарбовують розчином кристалічного фіолетового або робочим розчином карболфуксіна. Обережно промивають в посудині з водою, оставтяют на повітрі для висихання і проводять мікроскопію. Не допускається сушити мазок між листами фільтрувального паперу. Фон препарату забарвлюється тонкої суспензією чорної туші або тирозину. Тіла бактерій фарбуються монохроматично. капсули залишаються незабарвленими.

4.1.8.5. При ідентифікації стрептококів групи N рід ;! Streptococcus, стрептококів виду S. thennophilus визначають відсутність зростання на мясопептонном бульйоні з pH 9,6 і на м'ясо-пеітонном бульйоні з вмістом хлористого натрію 6.5%.

Для цього культури по н. 4.1.8 пересівають на середовища, зазначені в сб. 3.2.8 і 3.2.9.

Посіви інкубують при температурі (30 ± 1) 'С протягом 3 суг. а при ідентифікації S. thennophilus посіви інкубують при (45 ± 1) 'С протягом 3 діб.

4.2. Проведення випробування кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій

4.2.1. Приготування розведень кісломаточних продуктів (сухих і рідких) по ГОСТ 9225.

Для приготування розведень заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів мовляв очною! чутки бактерій краю фтакона і пакета протирають спиртом, край флакона обпалюють і виймають пробку, край пакета надрізають профламбіроканнимі ножицями, відважують I г випробуваного матеріалу в стерильну або профламбированное ступку, прикриту кришкою від чашки Петрі або стерильною папером, ретельно розтирають, додаючи невелику кількість розчину хлористого натрію або фосфатного буфера з колби, що містить 99 см "розчин ;! або буфера. суспендованих матеріал переливають в колбу з розчином, що залишився хлористого натрію або фосфатного буфера і здобувають другу розведення I: 100.

І друге розведень кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів маточнокіслих бактерій готують такі розведення відповідно до кількості маточнокіслих бактерій, зазначеним в нормативно-технічної документації, патьзуясьтабл. I.

4.2.2. Посів для підрахунку кількості молочнокислих стрептококів проводять в авізованого або рідку живильне середовище, приготовлену відповідно до ні. 3.3.2 і 3.3.3. а посів для підрахунку кількості молочнокислих наточек - в рідку середу, приготовлену відповідно до п. 3.3.3.

Для посіву в агарізо ванну живильне середовище вибирають тс розведення, при посіві яких на чашках виростає від 15 до 150 колоній.

З кожної проби роблять посів по ГОСТ 9225 1 см 3 відповідних розведень продукту (див. Табл. 1) на чашки Петрі.

При посіві в рідку живильне середовище з трьох-чотирьох останніх розведень (див. Табл. I) вносять по I см "кожного розведення в дві паралельні пробірки зі стерильним знежиреним молоком.

4.2.3. Пробірки або чашки Петрі з посівами поміщають в термостат та інкубують при температурі (30 ± 1) ° С для підрахунку мезофільних молочнокислих бактерій, при температурі (40 ± 1) ° С для підрахунку термофільних молочнокислих бактерій і при (32 ± 1) ° С для спільного підрахунку мезофільних і термофільних молочнокислих бактерій. Посіви інкубують протягом 72 год.

5. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

5.1. Обробка результатів аналізу харчових продуктів (крім кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів, бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій)

5.1.1. Результати аналізу харчового продукту оцінюють по кожній пробі окремо.

5.1.2. Якщо при вивченні культуральних, морфолошческіх і біохімічних властивостей при визначенні:

молочнокислих мікроорганізмів виявлені грампаложітельние. нерухомі, каталазоотріцательние палички або неспорообра зуюших. грампаложітельние. нерухомі, каталазоотріца-тільні або утворюють псевдо кагал азу коки, додають висновок про те. що виявлені мікроорганізми відносяться до молочнокислим;

бактерій роду Lactobacillus виявлені неспорообразующие, грампозитивні, нерухомі. каталазоотріцательние палички, то дають висновок про те. що виявлені мікроорганізми відносяться до роду Lactobacillus;

бактерій роду Lcuconostoc виявлені неспорообразующие, грампаложітельние. нерухомі, каталазоотріцательние, оточені капсулою коки, то дають висновок про те. що виявлені мікроорганізми відносяться до роду Leuconostoc:

бактерій роду Streptococcus групи N виявлені неспорообрлзуюшіе. грампаложітельние. нерухомі, каталазоотріцательние, що не дають зростання в поживних середовищах з pH 9.6 і 6.5% NaCI. коки, то дають висновок про те. що виявлені мікроорганізми відносяться до роду Streptococcus групи N;

бактерій роду Pediocoecus виявлені неспорообразующие, грампозитивні. нерухомі, каталазоотріцательние (або каталазопаложлгтельние. але дають негативний бензидинового тест) або псевдокаталазоположітельние коки, го дають висновок про те. що виявлені мікроорганізми відносяться до роду Pediocoecus;

бактерій виду S.thermophilus виявлені неспорообра зуюших. фамположітельние. нерухомі. катав азоотр іцател ьн ті. лермофільние коки, які не даюшіе зростання в поживних середовищах з pH 9.6 і 6.5% NaCI. го дають висновок про те. що виявлені мікроорганізми відносяться до виду Streptococcus themiophilus.

5.1.3. Якщо МРІ підтвердження характерних колоній в 80% випадків, тобто не менше ніж в 4 з 5 колоній підтверджений зростання певних груп або пологів мікроорганізмів, то вважають, що всі характерні колонії, що виросли на чашці, належать до цієї групи, роду або виду. В інших випадках кількість мікроорганізмів визначають, виходячи з процентного відношення підтверджених колоній до загальної кількості характерних колоній, взятих для підтвердження.

5.1.4. При визначенні НВЧ або при посіві продукту на рідкі середовища пробірки вважаються позитивними, якщо при подальшому пересеве на агаріеованние середовища і підтвердження характерних колоній хоча б в одній характерній колонії виявлені мікроорганізми визначаються груп, роду чи виду.

5.1.5. Найбільш ймовірне число (НВЧ) мікроорганізмів визначають за кількістю позитивних пробірок по ГОСТ 30425.

Якщо десятикратні розведення, вибрані для посіву були вищими, наприклад 10 -5. 10 "4 і 10" \ то табличне значення НВЧ множать на різницю між обраними і табличними десятикратними разведениями, тобто на 100.

Якщо десятикратні розведення, вибрані для посіву, були нижчими, наприклад 10 ° (1 г). 10 "". 10 ~ 2, то табличне значення НВЧ ділять на різницю між обраними і табличними десятикратними разведениями, тобто на 10.

5.1.6. Результати визначення кількості мікроорганізмів методом посіву в чашки Петрі або методом Н ВЧ або із застосуванням методу мембранної фільтрації перераховують на I г або 1 см "продукту і записують відповідно до вимог ГОСТ 26670.

5.1.7. Результати визначення присутності мікроорганізмів в певній навішуванні продукту висловлюють таким чином: молочнокислі мікроорганізми (при необхідності вказується рід або вид) виявлені або не виявлені в навішуванні продукту.

5.2. Обробка результатів аналізу кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій.

5.2.1. При розвитку молочнокислих бактерій на рідкому середовищі-молоці - молоко згортається.

Для підрахунку загальної кількості молочнокислих бактерій (стрептококів і паличок) відзначають три останніх розведення, в яких молоко згорнулося.

Складають числову характеристику. Вона складається з трьох цифр, що вказують число пробірок зі зсілим молоком в лрех останніх розведеннях. Перша цифра числової характеристики відповідає тому розведення, при якому в двох пробірках молоко згорнулося. Наступні цифри позначають число пробірок зі зсілим молоком в двох наступних розведеннях.

За чісювой характеристиці по табл. 2 знаходять найбільш ймовірне число молочнокислих мікроорганізмів. яке множать на те розведення, з якого починається перша цифра числової характеристики.

Таблиця 2

числова характеристика	Найбільш ісроі1Кос число мікроорганізмів при зараженні двох паралельних пробірок	числова характеристика	Найбільш ймовірне число мікроорганізмів при "зараженні двох паралельних пробірок

Не включені неприйнятні комбінації.

Отримане число відповідає кількості клітин молочнокислих бактерій в 1 г або 1 см 'продукту.

Видання офіційне Передрук заборонена

З 1 липня 2002 р введений в дію ГОСТ 24104 - 2001. На території Російської Федерації діє ГОСТ Р 53228-2008.

На території Російської Федерації діє

ГОСТ 10444.11-89

ДЕРЖАВНИЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТИ ХАРЧОВІ

МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ молочнокислих МИКРООРГАНИЗМОВ

видання офіційне

Стандартинформ

УДК 663 / .665.3.001.4: 006.354

ДЕРЖАВНИЙ

Група Н09

СТАНДАРТ

ПРОДУКТИ ХАРЧОВІ Методи визначення молочнокислих мікроорганізмів

Food products. Methods for determination of the lactic acid bacteria

МКС 07.100.30 ОКСТУ 9109

Дата введення 01.01.91

Цей стандарт поширюється на харчові і кисломолочні продукти, закваски, бактеріальні концентрати та бактеріальні препарати молочнокислих бактерій і встановлює метод визначення життєздатних молочнокислих мікроорганізмів і їх найбільш вірогідного числа (НВЧ), а також методи визначення в харчових продуктах (крім кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій) бактерій родів Lactobacillus, Leuconostoc, стрептококів групи N роду Streptococcus, Pediococcus, S. thermophilus і визначення найбільш ймовірного числа (НВЧ) бактерій роду Lactobacillus.

Метод заснований на висіві певної кількості продукту і (або) його розведень в рідкі або щільних селективні поживні середовища, культивуванні посівів при оптимальних умовах і, при необхідності, визначенні морфологічних і біохімічних властивостей виявлених мікроорганізмів і їх підрахунку.

Метод призначений для:

встановлення відповідності мікробіологічних показників якості харчових і кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій вимогам нормативно-технічної документації;

встановлення промислової стерильності консервів;

з'ясування причин виникнення дефектів харчових продуктів.

1. ВІДБІР І ПІДГОТОВКА ПРОБ

1.1. Відбір і підготовка проб харчових продуктів, крім кисломолочних, - по ГОСТ 26668, 26669.

1.2. Консерви перевіряють на герметичність - по ГОСТ 8756.18.

Повні консерви, нормальні за зовнішнім виглядом, перед випробуванням термостатируют при 30-37 ° С в тарі місткістю до 1 дм 3 включно не менше 5 діб, в тарі місткістю понад 1 дм 3 - не менше 7 діб.

Розведення продуктів готують на пептонно-сольовому розчині по ГОСТ 26669.

Вихідні розведення продуктів з масовою часткою NaCl більше 5% готують з використанням пептонною води; вихідні розведення рибних і м'ясних продуктів готують з використанням фізіологічного розчину.

* На території Російської Федерації діє ГОСТ Р 53430-2009.

Видання офіційне Передрук заборонена

2. АПАРАТУРА, МАТЕРІАЛИ І РЕАКТИВИ

Для проведення випробування застосовують апаратуру, матеріали, реактиви по ГОСТ 10444.1, ГОСТ 9225 і зазначені нижче:

ваги лабораторні загального призначення з метрологічними характеристиками згідно з ГОСТ 24104 *, з найбільшою межею зважування до 200 г і межею допустимої похибки ± 2 мг (для зважування реактивів);

ваги лабораторні загального призначення з метрологічними характеристиками згідно з ГОСТ 24104 *, з найбільшою межею зважування до 200 г і межею допустимої похибки ± 15 мг (для зважування продукту);

мікроскоп світловий біологічний з пристосуванням для фазово-контрастного Мікроскопують-вання або інших аналогічних марок; скла покривні по ГОСТ 6672; скла предметні по ГОСТ 9284;

термостат з діапазоном робочих температур від 28-55 ° С, що дозволяє підтримувати задану температуру з точністю ± 1 ° С; пробки коркові по ГОСТ 5541;

лупа складна кишенькова, що дає збільшення в 4-10 разів по ГОСТ 25706; панкреатин для бактеріальних і вірусологічних препаратів; хлороформ технічний по ГОСТ 20015;

молоко знежирене кислотністю не більше 19 ° Т, що отримується з коров'ячого молока, заготовляється не нижче 2-го сорту за ГОСТ 13264 ** або молоко сухе знежирене за ГОСТ 10970 ***; L-аргінін гідрохлорид; бензидин основний або солянокислий; калію цитрат; карбоксілметілцеллюлоза; твін-80; натрію ацетат; амонію цитрат;

магнію сульфат (MgS0 4 7Н 2 0);

марганцю сульфат (MnS0 4 2Н 2 0);

марганцю сульфат (MnS0 4 4Н 2 0);

кислота сорбінова;

нігрозин;

3. ПІДГОТОВКА ДО ВИПРОБУВАННЯ

3.1.1. Бромкрезоловий пурпурний індикатор, розчин масовою концентрацією 1 г / дм 3: 0,1 г бромкрезолового пурпурного з дотриманням правил асептики переносять, змиваючи стерильною дистильованою водою, в мірний посуд місткістю 100 см 3, доводять об'єм цієї ж водою до мітки. Розчин зберігають не більше 3 міс при кімнатній температурі.

3.1.2. Кальцій вуглекислий, водна суспензія масовою концентрацією 30 г / дм 3: 3 г вуглекислого кальцію, простерилізованого по ГОСТ 10444.1, переносять, змиваючи дистильованою водою, в мірний посуд місткістю 100 см 3, доводять об'єм до мітки. Суспензію стерилізують при температурі (121 + 1) ° С протягом 20 хв. Суспензію зберігають не більше 3 міс при кімнатній температурі.

3.1.3. Карболфуксін, концентрований розчин: 1 г фуксину змішують з 10 см 3 96% -ного етилового спирту і 100 см 3 розчину фенолу масовою концентрацією 50 г / дм 3.

Для приготування робочого розчину карболфуксіна до 10 см 3 концентрованого розчину карболфуксіна додають 90 см 3 дистильованої води.

3.1.4. Кристалічний фіолетовий розчин масовою концентрацією 10 г / дм 3: 1 г кристалічного фіолетового переносять, змиваючи дистильованою водою, в мірний посуд місткістю 100 см 3, об'єм доводять до мітки. Розчин зберігають не більше 3 міс при кімнатній температурі.

* З 1 липня 2002 р введений в дію ГОСТ 24104-2001. На території Російської Федерації діє ГОСТ Р 53228-2008.

** На території Російської Федерації діє ГОСТ Р 52054-2003.

*** На території Російської Федерації діє ГОСТ Р 52791-2007.

3.1.5. Нігрозину суспензія масової концентрації 100 г / дм 3: 10 г нігрозину переносять, змиваючи дистильованою водою, в мірний посуд місткістю 100 см 3, об'єм доводять до мітки, нагрівають до температури 45-50 ° С на водяній бані, потім фільтрують через ватно-марлевий фільтр.

3.1.6. Пептонно-сольовий розчин готують по ГОСТ 26669.

3.1.7. Пептонную воду готують по ГОСТ 26669.

3.1.8. Сорбінова кислота, лужний розчин: 1 г сорбінової кислоти переносять, змиваючи розчином гідроксиду натрію з NaOH = 1 моль / дм 3, в мірний посуд місткістю 100 см 3, об'єм доводять до мітки тим же розчином. Отриманий розчин стерилізують методом мембранної фільтрації по ГОСТ 26670.

Допускається готувати розчин сорбінової кислоти без фільтрації з дотриманням правил асептики, при цьому розчин гідроксиду натрію готують на стерильній дистильованій воді.

3.1.9. Реактив для визначення цитохромов: 1 г бензидину основного або солянокислого розчиняють в 20 см 3 99,8% -ної крижаної оцтової кислоти, додають 30 см 3 дистильованої води і повільно нагрівають, після охолодження в розчин вносять 50 см 3 96% -ного етилового спирту . Розчин зберігають в холодильнику протягом 1 міс.

3.1.10. Фізіологічний розчин готують по ГОСТ 10444.1.

3.2. Приготування поживних середовищ для випробування харчових продуктів (крім кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій)

3.2.1. Середу Блікфельдта щільну готують по ГОСТ 10444.1.

3.2.2. Середа Блікфельдта рідка: в 950 см 3 дистильованої води розчиняють 10 г лактози, 10 г глюкози, 5 г пептона, кип'ятять і фільтрують через паперовий фільтр. До фільтрату додають 20 см 3 дріжджового екстракту, 32 см 3 розчину бромкрезолового пурпурного з футболу. 3.1.1, встановлюють pH 7,3 + 0,1, розливають в стерильні пробірки і стерилізують при температурі (117 ± 1) ° Св протягом 20 хв.

3.2.3. Середа Брігс, в модифікації Шарп:

в 875 см 3 дистильованої води вносять 15 г пептона, 20 г глюкози, 25 см 3 дріжджового екстракту, 5 г оцтовокислого натрію, 5 г калію фосфорнокислого однозамещенного, 2 г амонію лімоннокіслого, 100 см 3 томатного соку (в розрахунку на те, що в соку міститься не менше 4,5% розчинних сухих речовин, якщо в томатному соку міститься інша кількість сухих речовин, то роблять перерахунок на вміст сухих речовин 4,5%), 1 см 3 твін - 80, 5 см 3 розчину солей (MgS0 4 7Н 2 0 - 11,5 г, MnS0 4 4Н 2 0 - 2,86 г, FeS0 4 7Н 2 0 - 0,68 г, дистильована вода до 100 см 3), 15 г агару.

Суміш кип'ятять на слабкому вогні до повного розчинення агару. Встановлюють pH таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (6,5 + 0,1). Середовище стерилізують при температурі (115 + 1) ° С протягом 15 хв.

3.2.4. Середа дріжджова: в 100 см 3 дріжджового екстракту, приготованого по ГОСТ 10444.1, додають 900 см 3 дистильованої води, 10 г простерилізованого по ГОСТ 10444.1 вуглекислого кальцію і 100 г сахарози. Суміш нагрівають до розчинення сахарози, встановлюють pH таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (7,1 ± 0,1), розливають в пробірки по 10 см 3 і стерилізують при температурі (121 + 1) ° С протягом 15 хвилин.

3.2.5. Середу капустяний агар готують по ГОСТ 10444.1.

3.2.6. Середа МРС рідка: в мірну колбу місткістю 1,0 дм 3 поміщають 10 г пептона, 20 см 3 дріжджового екстракту, 20,0 г глюкози, 1,0 см 3 твін - 80, 2,0 г калію фосфорнокислого двузамещен-ного, 5 , 0 г натрію ацетату, 2,0 г тріаммонія цитрату, 0,2 г сульфату магнію, 0,05 г сульфату марганцю (MnS0 4 4Н 2 0), доливають до мітки м'ясну воду; розчиняють компоненти нагріванням на водяній бані і встановлюють pH таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (6,2 + 0,1). Середовище розливають по 10 см 3 в стерильні пробірки і стерилізують в автоклаві при температурі (121 + 1) ° С протягом 15 хв. Пробірки з живильним середовищем зберігають при температурі (4 + 1) ° С не більше 30 діб.

3.2.7. Середу МРС щільних готують за рецептурою, зазначеної в і. 3.2.6, з додаванням 15-18 г агару. Після розчинення компонентів середу розливають в стерильні колби і стерилізують в автоклаві при температурі (121 + 1) ° С протягом 15 хв. Готове середовище зберігають при температурі (4 + 1) ° С не більше 30 діб.

При необхідності, для підвищення селективності, після стерилізації до 1 дм 3 агаризованому або рідкого середовища додають 1 см 3 лужного розчину сорбінової кислоти з футболу. 3.1.8.

3.2.8. Середа м'ясо-пептони бульйон з pH 9,6:

в м'ясо-пептонном бульйоні, приготованому з ГОСТ 10444.1, встановлюють pH за допомогою розчинів лугу і кислоти по ГОСТ 10444.1 таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С 9,6. Середовище стерилізують при температурі (121 + 1) ° С протягом 20 хв.

3.2.9. Середу м'ясо-пептони бульйон з вмістом хлористого натрію 6,5% готують по ГОСТ

10444.1, але при приготуванні збільшують кількість доданого хлористого натрію до 65 г на 1 дм 3 середовища.

3.2.10. Середовище живильне агар з сахарозою:

100,0 г сахарози, 15,0 г агару додають в 1 дм 3 м'ясо-пептонного бульйону, періодично перемішуючи, суміш нагрівають до кипіння і повного розчинення всіх компонентів.

Середу охолоджують до 45-55 ° С і встановлюють pH таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (7,1 + 0,1).

Середовище розливають в колби і стерилізують протягом 15 хв при температурі (121 + 1) ° С. Після стерилізації і перевірки pH середу добре перемішують і розливають у чашки Петрі, зберігають при температурі (4 + 1) ° С не більше 14 діб.

3.2.11. Середа Редді: основа середовища - в колбу, що містить 500 см 3 дистильованої води, додають 15,0 г агару і нагрівають на водяній бані до розчинення агару. В іншу колбу, що містить 500 см 3 дистильованої води, додають 10,0 г цитрату калію і 15,0 г карбоксілметілцеллю-лози і розчиняють при нагріванні. Вміст обох колб змішують і додають 3,0 г пептона, 25 см 3 дріжджового екстракту, 1,25 г калію фосфорнокислого двузамещенного, 5,0 г L-аргінін гідрохлориду, нагрівають на водяній бані до повного розчинення компонентів, охолоджують до температури 45-55 ° С і встановлюють pH таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (6,3 ± 0,2). Основу середовища стерилізують при температурі (121 + 1) ° С протягом 15 хв і зберігають при температурі (4 + 1) ° С не більше 30 діб.

Для приготування живильного середовища до 1 дм 3 розплавленої та охолодженої до 45-55 ° С основи додають 5,0 см 3 стерильного знежиреного молока, 100 см 3 суспензії вуглекислого кальцію масовою концентрацією 30 г / дм 3 і 2 см 3 розчину бромкрезолового пурпурного масовою концентрацією 1 г / дм 3.

3.2.12. Середа Рогоза рідка: в мірну колбу місткістю 1,0 дм 3 поміщають 10,0 г пептона,

25.0 см 3 дріжджового екстракту, 20,0 г глюкози, 1,0 см 3 твін - 80, 6,0 г калію фосфорнокислого однозамещенного, 2,0 г цитрату амонію, 25,0 г ацетату натрію, 1,32 см 3 крижаної оцтової кислоти, 0,575 г сульфату магнію, 0,12 г сульфату марганцю (MnS0 4 2Н 2 0), 0,034 г сульфату заліза, доливають до мітки дистильовану воду, розчиняють компоненти нагріванням на водяній бані і встановлюють pH таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (5,4 + 0,1). Середовище розливають по 10 см 3 в стерильні пробірки і стерилізують в автоклаві при температурі (121 + 1) ° С протягом 15 хв. Пробірки з живильним середовищем зберігають при температурі (4 + 1) ° С не більше 30 діб.

3.2.13. Середу Рогоза щільних готують за рецептурою, описаної в і. 3.2.12, з додаванням

20.0 г агару. Після розчинення компонентів середу розливають в стерильні колби і стерилізують в автоклаві при температурі (121 + 1) ° С протягом 15 хв. Готове середовище зберігають при температурі (4 + 1) ° С не більше 30 діб.

3.2.14. Середу з томатного соку готують по ГОСТ 10444.1.

3.2.15. Середовище для визначення псевдокаталази: в мірну колбу місткістю 1 дм 3 поміщають

5.0 пептона, 25 см 3 дріжджового екстракту, 0,5 см 3 твін - 80, 0,1 г (MnS0 4 4Н 2 0), 0,5 г глюкози, 15 г агару доливають м'ясо-пептони бульйоном до мітки, розчиняють компоненти нагріванням на водяній бані і встановлюють pH таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (6,9 + 0,1). Середовище розливають в пробірки по 5-7 см 3 і стерилізують в автоклаві при температурі (121 + 1) ° С протягом 15 хв. Після стерилізації пробірки укладають на похилу поверхню для отримання косяків.

3.2.16. Середа Lee:

основа середовища - в мірну колбу місткістю 1 дм 3 поміщають 10,0 г пептона, 50 см 3 дріжджового екстракту, 5,0 г лактози, 3,0 г вуглекислого кальцію, простерилізованого по ГОСТ 10444.1, 0,5 г Na 2 HP0 4, 18 г агару, доливають дистильованою водою до мітки, розчиняють компоненти нагріванням на водяній бані і встановлюють pH таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (7,0 ± 1). Середовище стерилізують в автоклаві при температурі (121 + 1) ° С протягом 20 хв і, при необхідності, зберігають при температурі (4 + 1) ° С не більше 30 діб.

Для приготування живильного середовища до 1 дм 3 основи додають 20 см 3 стерильного розчину бромкрезолового пурпурного з масовою концентрацією 1 г / дм 3, перемішують і розливають у чашки Петрі. Середу зберігають при температурі (4 + 1) ° С не більше 7 діб.

3.3. Приготування поживних середовищ для випробування кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій

3.3.1. Приготування гидролизованного молока

Натуральне або відновлене знежирене молоко кип'ятять або обробляють текучим паром протягом 20 хв і охолоджують до температури (45 + 2) ° С. Доводять активну кислотність до pH (7,7 + 0,1), додаючи водний розчин з масовою часткою NaOH 40%. До 1000 см 3 молока додають від 0,5 до 1,0 г порошку панкреатину. Потім до молока додають від 5 до 6 см 3 хлороформу. Колбу закривають корковою пробкою і витримують при температурі (40 + 2) ° С протягом 18-24 год. Протягом перших 3-5 ч молоко 2-3 рази премешівают (пробку після перемішування відкривають для видалення хлороформу).

Потім гідролізований молокофільтрують через паперовий фільтр, розводять дистильованою водою у співвідношенні 1: 1, встановлюють активну кислотність pH (7,1 + 0,1), додаючи водний розчин з масовою часткою NaOH 40% і використовують для приготування агару з гідролізованим молоком. У разі зберігання Гідролізований молоко стерилізують в автоклаві при температурі (121 + 1) ° С протягом 15 хв.

3.3.2. Приготування агару з гідролізованим молоком

Гідролізований молоко, см 3 - 1000;

агар, г - 15.

К1000 см 3 гидролизованного молока додають 15 г агару. Середу нагрівають до повного розплавлення агару і фільтрують через вату, розливають у пробірки або колби і стерилізують в автоклаві при температурі (121 + 1) ° С протягом (10 + 1) хв.

3.3.3. Приготування стерильного знежиреного молока

Натуральне або відновлене знежирене молоко розливають по 10 см 3 в пробірки і стерилізують при температурі (121 + 1) ° С протягом (10 + 1) хв.

4. ПРОВЕДЕННЯ ВИПРОБУВАННЯ

4.1. Проведення випробування харчових продуктів (крім кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій)

4.1.1. Для визначення мікроорганізмів використовують підготовлену пробу продукту або його вихідне розведення.

Для визначення присутності і підрахунку кількості мікроорганізмів на чашках Петрі з проби харчового продукту або з вихідного розведення готують ряд розведень відповідно до допустимою кількістю мікроорганізмів, зазначених у нормативно-технічної документації на конкретний вид харчового продукту.

Для підрахунку НВЧ з проби харчового продукту готують вихідне і ряд десятикратних розведень таким чином, щоб в посівах найбільшого розведення мікроорганізми не були виявлені. Для посіву вибирають не менше трьох послідовних розведень. З кожного розведення засівають три паралельні пробірки.

4.1.2. Для посіву в рідкі середовища за методом НВЧ і на чашки Петрі глибинним методом відбирають по 1,0 см 3 підготовленої проби продукту і (або) його розведення, для посіву на чашки Петрі поверхневим методом - по 0,1-0,2 см 3.

При застосуванні методу мембранних фільтрів фільтрують обсяг рідкого продукту, який вказаний в нормативно-технічної документації на конкретний вид харчового продукту.

4.1.3. Для визначення присутності або підрахунку НВЧ молочнокислих мікроорганізмів проводять посів на одну з рідких середовищ, зазначених в пп. 3.2.2, 3.2.6 або 3.2.12.

Якщо після внесення продукту в середу Блікфельдта середовище змінилося колір, то в неї додають кілька крапель розчину стерильною лугу (NaOH або КОН) масовою концентрацією 50 г / дм 3 до відновлення первинного забарвлення.

Для визначення присутності або підрахунку кількості молочнокислих мікроорганізмів допускається замість посіву в рідкі середовища проводити посів глибинним методом в одну з щільних середовищ, зазначених в пп.3.2.1, 3.2.5, 3.2.7, 3.2.13 або 3.2.14.

Для визначення присутності або підрахунку НВЧ бактерій роду Lactobacillus проводять посів на одну з рідких середовищ, зазначених в пп. 3.2.6 або 3.2.12.

Для визначення присутності або підрахунку кількості бактерій роду Lactobacillus замість посіву в рідкі середовища проводять посів глибинним методом в одну з щільних середовищ, зазначених в пп. 3.2.7 або 3.2.13.

Для визначення присутності бактерій роду Leuconostoc проводять посів на рідку середу, зазначену в п. 3.2.4.

Для визначення присутності або підрахунку кількості стрептококів групи N роду Streptococcus проводять посів глибинним методом в щільних середу, зазначену в п. 3.2.11, а для S.thermophilus використовують середу по п. 3.2.16.

4.1.4. Посіви для визначення присутності або підрахунку кількості молочнокислих мікроорганізмів, бактерій родів Lactobacillus стрептококів групи N роду Streptococcus инкубируют не більше 5 діб при температурі (30 + 1) ° С або не більше 3 діб при температурі (37 + 1) ° С; посіви для визначення присутності або підрахунку кількості бактерій роду Leuconostoc инкубируют не більше 5 діб при температурі (22 + 1) ° С. Посіви для визначення присутності або підрахунку кількості S.thermophilus инкубируют (48 + 3) ч при температурі (45 + 1) ° С. Посіви на чашках Петрі для визначення присутності або підрахунку кількості бактерій роду Leuconostoc инкубируют дном вниз.

Інкубування посівів на рідких середовищах припиняють при появі видимих ознак

Попередній підрахунок колоній на щільних середовищах проводять через 48 ч.

на застиглу живильне середовище в чашках Петрі наливають другий шар розплавленої та охолодженої до (45 + 1) ° С агаризованому середовища в кількості 5,0 см 3 і залишають до затвердіння;

чашки Петрі поміщають в газове середовище, що складається з 95% N 2 і 5% С0 2;

чашки Петрі поміщають в анаеростатах. Апарат закривають, за допомогою вакуумного насоса створюють вакуум 86,6-93,3 кПа;

4.1.6. Посіви на рідких середовищах щодня переглядають і відбирають пробірки з видимими ознаками росту. Характер зростання на рідких середовищах наведено в додатку 2. З пробірок з ознаками росту проводять пересів на щільних середовища (див. П. 4.1.3) бактеріологічною петлею так, щоб отримати зростання ізольованих колоній. Посіви інкубують по п. 4.1.4.

Характеристика характерних колоній приведена в додатку 2.

4.1.8. Для підтвердження належності характерних колоній до молочнокислим мікроорганізмам або бактеріям одного з родів Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus стрептококів групи N роду Streptococcus, S.thermophilus, відбирають з посівів по п. 4.1.7 або 4.1.6 не менше 5 характерних колоній. Належність кожної відібраної колонії до певних мікроорганізмів встановлюють по відношенню до фарбування за Грамом, рухливості, наявності каталази, додатково при ідентифікації бактерій роду Leuconostos визначають наявність капсул, при ідентифікації стрептококи

ков виду S.thermophilus і стрептококів групи N роду Streptococcus - наявність зростання в мясопептонном бульйоні з pH 9,6 і в мясопептонном бульйоні з 6,5% NaCl.

4.1.8.3. Каталазну активність культур визначають за ГОСТ 30425.

Результати визначення каталазной активності оцінюють згідно з додатком 1.

Розкладання перекису водню у бактерій роду Pediococcus можливо за рахунок ферменту псевдокаталази. Тому при визначенні молочнокислих мікроорганізмів або бактерій роду Pediococcus в разі, якщо в характерних колоніях виявлено грампозитивні, нерухомі мікроорганізми, що дають позитивну каталазну реакцію, контролюють відсутність цито-хромові шляхом постановки бензидинового тесту. Для цього виросли на чашках Петрі колонії бактерій 24-48-годинного віку заливають розчином бензидину, зазначеним в і. 3.1.9. Після того, як розчин оживляти колонії, додають в чашку приблизно такий же обсяг 5% -ного перекису водню. Молочнокислі мікроорганізми, в тому числі бактерії роду Pediococcus, не містять цитохромов. У разі присутності цитохромов колонії забарвлюються в блакитно-зелений або яскраво-блакитний колір.

При відсутності бензидина допускається проводити визначення наявності псевдокаталази на середовищі і. 3.2.15 з низькою концентрацією глюкози - 0,05%.

Посіви інкубують з футболу. 4.1.4, визначення псевдокаталази проводять також як і каталази по ГОСТ 30425.

Культури, що утворюють псевдокаталазу, відносять до роду Pediococcus.

За допомогою іншого скла з шліфованими краями швидко готують тонкий мазок, який фіксують, кілька разів проводячи його через полум'я пальника. Мазок дофарбовують розчином кристалічного фіолетового або робочим розчином карболфуксіна. Обережно промивають в посудині з водою, залишають на повітрі для висихання і проводять мікроскопію. Не допускається сушити мазок між листами фільтрувального паперу. Фон препарату забарвлюється тонкої суспензією чорної туші або нігрозину. Тіла бактерій фарбуються монохроматично, капсули залишаються незабарвленими.

4.1.8.5. При ідентифікації стрептококів групи N роду Streptococcus, стрептококів виду S. thermophilus визначають відсутність зростання на мясопептонном бульйоні з pH 9,6 і на мясопептонном бульйоні з вмістом хлористого натрію 6,5%.

Для цього культури з футболу. 4.1.8 пересівають на середовища, зазначені в пі. 3.2.8 і 3.2.9.

Посіви інкубують при температурі (30 + 1) ° С протягом 3 діб, а при ідентифікації

S. thermophilus посіви інкубують при (45 + 1) ° С протягом 3 діб.

4.2. Проведення випробування кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій

4.2.1. Приготування розведень кисломолочних продуктів (сухих і рідких) по ГОСТ 9225.

Для приготування розведень заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій краю флакона і пакета протирають спиртом, край флакона обпалюють і виймають пробку, край пакета надрізають профламбированное ножицями, відважують 1 г випробуваного матеріалу в стерильну або профламбированное ступку, прикриту кришкою від чашки Петрі або стерильною папером, ретельно розтирають, додаючи невелику кількість розчину хлористого натрію або фосфатного буфера з колби, що містить 99 см 3 розчину або буфера. Суспендованих матеріал переливають в колбу з розчином, що залишився хлористого натрію або фосфатного буфера і здобувають другу розведення 1: 100.

І друге розведень кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій готують такі розведення відповідно до кількості молочнокислих бактерій, зазначеним в нормативно-технічної документації, користуючись табл. 1.

Таблиця 1

4.2.2. Посів для підрахунку кількості молочнокислих стрептококів проводять в щільних-ву або рідку живильне середовище, приготовлену відповідно до пі. 3.3.2 і 3.3.3, а посів для підрахунку кількості молочнокислих паличок - в рідку середу, приготовлену відповідно до п. 3.3.3.

Для посіву в щільних живильне середовище вибирають ті розведення, при посіві яких на чашках виростає від 15 до 150 колоній.

З кожної проби роблять посів по ГОСТ 9225 1 см 3 відповідних розведень продукту (див. Табл. 1) на чашки Петрі.

При посіві в рідку живильне середовище з трьох-чотирьох останніх розведень (див. Табл. 1) вносять по 1 см 3 кожного розведення в дві паралельні пробірки зі стерильним знежиреним молоком.

4.2.3. Пробірки або чашки Петрі з посівами поміщають в термостат та інкубують при температурі (30 + 1) ° С для підрахунку мезофільних молочнокислих бактерій, при температурі (40 + 1) ° С для підрахунку термофільних молочнокислих бактерій і при (32 + 1) ° С для спільного підрахунку мезофільних і термофільних молочнокислих бактерій. Посіви інкубують протягом 72 год.

5. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

5.1. Обробка результатів аналізу харчових продуктів (крім кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів, бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій)

5.1.1. Результати аналізу харчового продукту оцінюють по кожній пробі окремо.

5.1.2. Якщо при вивченні культуральних, морфологічних і біохімічних властивостей при визначенні:

молочнокислих мікроорганізмів виявлені грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние палички або неспорообразующие, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние або утворюють псевдокаталазу коки, то дають висновок про те, що виявлені мікроорганізми відносяться до молочнокислим;

бактерій роду Lactobacillus виявлені неспорообразующие, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние палички, то дають висновок про те, що виявлені мікроорганізми відносяться до роду Lactobacillus;

бактерій роду Leuconostoc виявлені неспорообразующие, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние, оточені капсулою коки, то дають висновок про те, що виявлені мікроорганізми відносяться до роду Leuconostoc;

бактерій роду Streptococcus групи N виявлені неспорообразующие, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние, що не дають зростання в поживних середовищах з pH 9,6 і 6,5% NaCl, коки, то дають висновок про те, що виявлені мікроорганізми відносяться до роду Streptococcus групи N;

бактерій роду Pediococcus виявлені неспорообразующие, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние (або каталазоположітельние, але дають негативний бензидинового тест) або псевдокаталазоположітельние коки, то дають висновок про те, що виявлені мікроорганізми відносяться до роду Pediococcus;

бактерій виду S.thermophilus виявлені неспорообразующие, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние, термофільні коки, що не дають зростання в поживних середовищах з pH 9,6 і 6,5% NaCl, то дають висновок про те, що виявлені мікроорганізми відносяться до виду Streptococcus thermophilus.

5.1.3. Якщо при підтвердженні характерних колоній в 80% випадків, тобто не менше ніж в 4 з 5 колоній підтверджений зростання певних груп або пологів мікроорганізмів, то вважають, що всі характерні колонії, що виросли на чашці, належать до цієї групи, роду або виду. В інших випадках кількість мікроорганізмів визначають, виходячи з процентного відношення підтверджених колоній до загальної кількості характерних колоній, взятих для підтвердження.

5.1.4. При визначенні НВЧ або при посіві продукту на рідкі середовища пробірки вважаються позитивними, якщо при подальшому пересеве на щільних середовища і підтвердження характерних колоній хоча б в одній характерній колонії виявлені мікроорганізми визначаються груп, роду чи виду.

5.1.5. Найбільш ймовірне число (НВЧ) мікроорганізмів визначають за кількістю позитивних пробірок по ГОСТ 30425.

Якщо десятикратні розведення, вибрані для посіву були вищими, наприклад 10 _3, 10 -4 і 10 -5, то табличне значення НВЧ множать на різницю між обраними і табличними десятикратними разведениями, тобто на 100.

Якщо десятикратні розведення, вибрані для посіву, були нижчими, наприклад 10 ° (1 г), 10 -1, 10 -2, то табличне значення НВЧ ділять на різницю між обраними і табличними десятикратними разведениями, тобто на 10.

5.1.6. Результати визначення кількості мікроорганізмів методом посіву в чашки Петрі або методом НВЧ або із застосуванням методу мембранної фільтрації перераховують на 1 г або 1 см 3 продукту і записують відповідно до вимог ГОСТ 26670.

5.2. Обробка результатів аналізу кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій.

5.2.1. При розвитку молочнокислих бактерій на рідкому середовищі-молоці - молоко згортається.

Складають числову характеристику. Вона складається з трьох цифр, що вказують число пробірок зі зсілим молоком в трьох останніх розведеннях. Перша цифра числової характеристики відповідає тому розведення, при якому в двох пробірках молоко згорнулося. Наступні цифри позначають число пробірок зі зсілим молоком в двох наступних розведеннях.

За числовий характеристиці по табл. 2 знаходять найбільш ймовірне число молочнокислих мікроорганізмів, яке множать на те розведення, з якого починається перша цифра числової характеристики.

Таблиця 2

Не включені неприйнятні комбінації.

Отримане число відповідає кількості клітин молочнокислих бактерій в 1 г або 1 см 3 продукту.

Приклад розрахунку найбільш ймовірного числа мікроорганізмів при зараженні двох паралельних пробірок наведено в додатку 3.

Якщо необхідно визначити диференційовано кількість стрептококів і паличок, то з пробірок, в яких молоко згорнулося, роблять мікроскопічний препарат по ГОСТ 9225, переглядають його і окремо відзначають пробірки, в яких є палички і стрептококи.

Підрахунок кількості молочнокислих стрептококів або паличок проводять, як зазначено вище.

5.2.2. Підрахунок кількості колоній, що виросли молочнокислих бактерій на агаризованому середовищі і перерахунок їх змісту в 1 г або 1 см 3 продукту проводять по ГОСТ 9225.

Додаток 1 Довідковий

ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Найменування мікроорганізмів

характеристика

Молочнокислі мікроорганізми (за винятком роду Sporolacto-bacillus ідентифікованого по ГОСТ 30425)

Бактерії роду Lactobacillus

Слизеобразующие бактерії роду Leuconostoc

Стрептококи групи N роду Streptococcus

Бактерії роду Pediococcus

Стрептококи виду S.thermophilus

Неспороутворюючих, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние палички або неспорообразующие, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние або утворюють псевдокаталазу коки

Грампозитивні, неспорообразующие короткі або довгі, нерухомі, каталазоотріцательние палички

Грампозитивні, неспорообразующие, що мають сферичну або овальну форму, розташовані попарно або в ланцюжках, оточені капсулою, яка по Граму не фарбується, нерухомі каталазоотріцательние коки

Грампозитивні, неспорообразующие, які розташовуються у вигляді коротких і довгих ланцюжків, нерухомі, каталазоотріцательние, що не дають зростання в поживних середовищах з pH 9,6 і 6,5% NaCl коки Грампозитивні, неспорообразующие, розташовані парами і тетрадами, нерухомі, каталазоотріцательние або утворюють псевдокаталазу коки

Грампозитивні, розташовані парами або у вигляді коротких або довгих ланцюжків, нерухомі, каталазоотріцательние, термофільні, що не дають зростання в поживних середовищах з pH 9,6 і 6,5% NaCl коки

Додаток 2 Довідковий

ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛОНІЙ молочнокислих мікроорганізмів щільних І ХАРАКТЕР ЗРОСТАННЯ НА РІДКИХ СЕРЕДОВИЩАХ

мікроорганізми	Живильне середовище	Характеристика колоній або характер росту на рідкому середовищі
молочнокислі мікроорганізми	Блікфельдта рідка	Зміна кольору середовища від фіолетового до жовтого, помутніння середовища або утворення осаду, можливе виділення газу
	Блікфельдта агарі-	Колонії дрібні гладкі або шеро-
	зовано, середа з томатного соку
	капустяний агар	Колонії оточені прозорою зоною
Молочнокислі бактерії роду	Рогоза і МРС агарі-	Колонії безбарвні діаметром від
Lactobacillus або молочнокислі мікро-	поклику	1 до 3 мм лінзоподібної або звездообраз-
організми		ної форми
	Рогоза і МРС рідкі	помутніння середовища
Молочнокислі бактерії роду	Агар поживний з	Колонії опуклі, округлі, слизу-
	сахарозою	стие. При видаленні колоній голкою або бактеріологічною петлею виявляються волокна слизу
Молочнокислі бактерії роду		S.lactis утворює колонії білі, крейда-
Streptococcus групи N		кі, круглі, навколо колоній можуть бути зони просвітління S.cremoris колонії дрібні, жовті, елліпсовідниє
Молочнокислі бактерії роду	Середа Брігс в моди-	Колонії дрібні, гладкі або шеро-
	фикации Шарп
Молочнокислі стрептококи виду		Колонії жовті, круглі або елліп-
		совідние, навколо яких спостерігаються зони просвітління

Додаток 3 Довідкове

ПРИКЛАД РОЗРАХУНКУ ймовірного числа молочнокислих бактерій

МЕТОДОМ ГРАНИЧНИХ розведення

Взяті розведення ................. 1: 10 1: 100 1: 1000 1: 10000

Число пробірок з посівами .......... 2 2 2 2

Число пробірок зі зсілим молоком.2 2 Будiвництво 1 1

Отже, числова характеристика буде 211. Вона відповідає за табл. 2 числа 13,0. Це число треба помножити на те розведення, з якого починалася перша цифра числової характеристики (в прикладі це розведення дорівнює 1: 100).

Таким чином в 1 см 3 міститься 1300 молочнокислих бактерій (13,0x100 = 1300).

Взяті розведення .................
Число пробірок з посівами ..........
Число пробірок зі зсілим молоком.
Стрептококи виявлені в мікроскопічес-
ких препаратах наступних розведень .........
Молочнокислі палички виявлені в мик-
роскопіческіх препаратах наступних розведень.
Числова характеристика дорівнює для: стрептококів. .

Ймовірне число мікробів одно для стрептококів.
татусів ...........................

Помноживши на розведення, отримуємо кількість стрептококів в 1 см 3 - 7000, паличок - 250.

ІНФОРМАЦІЙНІ ДАНІ

1. РОЗРОБЛЕНО І ВНЕСЕНО Держагропромом СРСР

2. ЗАТВЕРДЖЕНО І ВВЕДЕНО В ДІЮ Ухвалою Державного комітету СРСР з управління якістю продукції та стандартів від 28.11.89 № 3502

3. ЗАМІСТЬ ГОСТ 10444.11-75

4. НОРМАТИВНО-ТЕХНІЧНІ ДОКУМЕНТИ

Позначення НТД, на якій дана ссипка	номер пункту
ГОСТ 5541-2002
ГОСТ 6672-75
ГОСТ 8756.18-70
ГОСТ 9225-84	1.1, 2, 4.2.1, 4.2.2, 5.2.1, 5.2.2
ГОСТ 9284-75
ГОСТ 10444.1-84	2, 3.1.2, 3.1.10, 3.2.1, 3.2.4, 3.2.5, 3.2.8, 3.2.9, 3.2.14, 3.2.16
ГОСТ 10970-87
ГОСТ 13264-88
ГОСТ 20015-88
ГОСТ 24104-88
ГОСТ 25706-83
ГОСТ 26668-85
ГОСТ 26669-85	1.1, 1.2, 3.1.6, 3.1.7
ГОСТ 26670-91	3.1.8, 4.1.2, 5.1.6
ГОСТ 30425-97	4.1.5, 4.1.8.1, 4.1.8.3, 5.1.5, додаток 1

5. Обмеження терміну дії зняте по протоколу № 5-94 Міждержавної ради зі стандартизації, метрології та сертифікації (НПУ 11-12-94)

6. ПЕРЕВИДАННЯ. Квітень 2010 р

4.1.5, 4.1.8.1, 4.1.8.3, 5.1.5, додаток 1

5. Обмеження терміну дії зняте по протоколу N 5-94 Міждержавної ради зі стандартизації, метрології та сертифікації (ІУС 11-12-94)

6. ПЕРЕВИДАННЯ. Квітень 2010 р

Цей стандарт поширюється на харчові і кисломолочні продукти, закваски, бактеріальні концентрати та бактеріальні препарати молочнокислих бактерій і встановлює метод визначення життєздатних молочнокислих мікроорганізмів і їх найбільш вірогідного числа (НВЧ), а також методи визначення в харчових продуктах (крім кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій) бактерій родів Lactobacillus, Leuconostoc, стрептококів групи N роду Streptococcus, Pediococcus, S. thermophilus і визначення найбільш ймовірного числа (НВЧ) бактерій роду Lactobacillus.

Метод заснований на висіві певної кількості продукту і (або) його розведень в рідкі або щільних селективні поживні середовища, культивуванні посівів при оптимальних умовах і, при необхідності, визначенні морфологічних і біохімічних властивостей виявлених мікроорганізмів і їх підрахунку.

Метод призначений для:

встановлення відповідності мікробіологічних показників якості харчових і кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій вимогам нормативно-технічної документації;

встановлення промислової стерильності консервів;

з'ясування причин виникнення дефектів харчових продуктів.

1. ВІДБІР І ПІДГОТОВКА ПРОБ

1.1. Відбір і підготовка проб харчових продуктів, крім кисломолочних, - по ГОСТ 26668 , ГОСТ 26669.

Відбір проб кисломолочних продуктів (сухих і рідких), заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій і підготовка їх до аналізу - по ГОСТ 9225 *.
________________
ГОСТ Р 53430-2009.

1.2. Консерви перевіряють на герметичність - по ГОСТ 8756.18.

Повні консерви, нормальні за зовнішнім виглядом, перед випробуванням термостатируют при 30-37 ° С в тарі місткістю до 1 дм включно не менше 5 діб, в тарі місткістю понад 1 дм - не менше 7 діб.

Харчові продукти, в яких нормується кількість молочнокислих мікроорганізмів, термостатування не підлягають.

Розведення продуктів готують на пептонно-сольовому розчині по ГОСТ 26669.

Вихідні розведення продуктів з масовою часткою NaCl більше 5% готують з використанням пептонною води; вихідні розведення рибних і м'ясних продуктів готують з використанням фізіологічного розчину.

2. АПАРАТУРА, МАТЕРІАЛИ І РЕАКТИВИ

Для проведення випробування застосовують апаратуру, матеріали, реактиви по ГОСТ 10444.1 , ГОСТ 9225і такі:

ГОСТ 24104*, З найбільшою межею зважування до 200 г і межею допустимої похибки ± 2 мг (для зважування реактивів);
________________
ГОСТ 24104-2001 ГОСТ Р 53228-2008.

ваги лабораторні загального призначення з метрологічними характеристиками по ГОСТ 24104 *, З найбільшою межею зважування до 200 г і межею допустимої похибки ± 15 мг (для зважування продукту);
________________
* З 1 липня 2002 р введений в дію ГОСТ 24104-2001. На території Російської Федерації діє ГОСТ Р 53228-2008.

мікроскоп світловий біологічний з пристосуванням для фазово-контрастного микроскопирования або інших аналогічних марок;

скла покривні по ГОСТ 6672 ;

скла предметні по ГОСТ 9284 ;

термостат з діапазоном робочих температур від 28-55 ° С, що дозволяє підтримувати задану температуру з точністю ± 1 ° С;

пробки коркові по ГОСТ 5541 ;

лупа складна кишенькова, що дає збільшення в 4-10 разів по ГОСТ 25706 ;

панкреатин для бактеріальних і вірусологічних препаратів;

хлороформ технічний по ГОСТ 20015 ;

молоко знежирене кислотністю не більше 19 ° Т, що отримується з коров'ячого молока, заготовляється не нижче 2-го сорту за ГОСТ 13264 *, або молоко сухе знежирене по ГОСТ 10970 **;
________________
* На території Російської Федерації діє ГОСТ Р 52054-2003.
** На території Російської Федерації діє ГОСТ Р 52791-2007.

L-аргінін гідрохлорид;

бензидин основний або солянокислий;

калію цитрат;

карбоксілметілцеллюлоза;

твін-80;

натрію ацетат;

амонію цитрат;

магнію сульфат (MgSO · 7НО);

марганцю сульфат (MnSO · 2НО);

марганцю сульфат (MnSO · 4НО);

кислота сорбінова;

нігрозин;

фенол.

3. ПІДГОТОВКА ДО ВИПРОБУВАННЯ

3.1.1. Бромкрезоловий пурпурний індикатор, розчин масовою концентрацією 1 г / дм: 0,1 г бромкрезолового пурпурного з дотриманням правил асептики переносять, змиваючи стерильною дистильованою водою, в мірний посуд ємністю 100 мл, доводять об'єм цієї ж водою до мітки. Розчин зберігають не більше 3 міс при кімнатній температурі.

3.1.2. Кальцій вуглекислий, водна суспензія масовою концентрацією 30 г / дм 3 г вуглекислого кальцію, простерилізованого по ГОСТ 10444.1, Переносять, змиваючи дистильованою водою, в мірний посуд ємністю 100 мл, доводять об'єм до мітки. Суспензію стерилізують при температурі (121 ± 1) ° С протягом 20 хв. Суспензію зберігають не більше 3 міс при кімнатній температурі.

3.1.3. Карболфуксін, концентрований розчин: 1 г фуксину змішують з 10 см 96% -ного етилового спирту і 100 см розчину фенолу масовою концентрацією 50 г / дм.

Для приготування робочого розчину карболфуксіна до 10 см концентрованого розчину карболфуксіна додають 90 см дистильованої води.

3.1.4. Кристалічний фіолетовий розчин масовою концентрацією 10 г / дм: 1 г кристалічного фіолетового переносять, змиваючи дистильованою водою, в мірний посуд ємністю 100 мл, об'єм доводять до мітки. Розчин зберігають не більше 3 міс при кімнатній температурі.

3.1.5. Нігрозину суспензія масової концентрації 100 г / дм: 10 г нігрозину переносять, змиваючи дистильованою водою, в мірний посуд ємністю 100 мл, об'єм доводять до мітки, нагрівають до температури 45-50 ° С на водяній бані, потім фільтрують через ватно-марлевий фільтр.

3.1.6. Пептонно-сольовий розчин готують по ГОСТ 26669.

3.1.7. Пептонную воду готують по ГОСТ 26669.

3.1.8. Сорбінова кислота, лужний розчин: 1 г сорбінової кислоти переносять, змиваючи розчином гідроксиду натрію NaOH = 1 моль / дм, в мірний посуд ємністю 100 мл, об'єм доводять до мітки тим же розчином. Отриманий розчин стерилізують методом мембранної фільтрації по ГОСТ 26670.

Допускається готувати розчин сорбінової кислоти без фільтрації з дотриманням правил асептики, при цьому розчин гідроксиду натрію готують на стерильній дистильованій воді.

3.1.9. Реактив для визначення цитохромов: 1 г бензидину основного або солянокислого розчиняють в 20 см 99,8% -ної крижаної оцтової кислоти, додають 30 см дистильованої води і повільно нагрівають, після охолодження в розчин вносять 50 см96% -ного етилового спирту. Розчин зберігають в холодильнику протягом 1 міс.

3.1.10. Фізіологічний розчин готують по ГОСТ 10444.1.

3.2.1. Середу Блікфельдта щільну готують по ГОСТ 10444.1.

3.2.2. Середа Блікфельдта рідка: в 950 см дистильованої води розчиняють 10 г лактози, 10 г глюкози, 5 г пептона, кип'ятять і фільтрують через паперовий фільтр. До фільтрату додають 20 см дріжджового екстракту, 32 см розчину бромкрезолового пурпурного по п.3.1.1, встановлюють рН 7,3 ± 0,1, розливають в стерильні пробірки і стерилізують при температурі (117 ± 1) ° С протягом 20 хв.

3.2.3. Середа Брігс, в модифікації Шарп:

в 875 см дистильованої води вносять 15 г пептона, 20 г глюкози, 25 см дріжджового екстракту, 5 г оцтовокислого натрію, 5 г калію фосфорнокислого однозамещенного, 2 г амонію лімоннокіслого, 100 см томатного соку (в розрахунку на те, що в соку міститься не менше 4,5% розчинних сухих речовин, якщо в томатному соку міститься інша кількість сухих речовин, то роблять перерахунок на вміст сухих речовин 4,5%), 1 см твін-80, 5 см розчину солей (MgSO · 7НО - 11,5 г, MnSO · 4НО - 2,86 г, FeSO · 7НО - 0,68 г, дистильована вода до 100 см), 15 г агару.

Суміш кип'ятять на слабкому вогні до повного розчинення агару. Встановлюють рН таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (6,5 ± 0,1). Середовище стерилізують при температурі (115 ± 1) ° С протягом 15 хв.

3.2.4. Середа дріжджова: в 100 см дріжджового екстракту, приготованого по ГОСТ 10444.1, Додають 900 см дистильованої води, 10 г простерилізованого по ГОСТ 10444.1вуглекислого кальцію і 100 г сахарози. Суміш нагрівають до розчинення сахарози, встановлюють рН таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (7,1 ± 0,1), розливають в пробірки по 10 см і стерилізують при температурі (121 ± 1) ° С протягом 15 хв.

3.2.5. Середу капустяний агар готують по ГОСТ 10444.1.

3.2.6. Середа МРС рідка: в мірну колбу місткістю 1,0 дм поміщають 10 г пептона, 20 см дріжджового екстракту, 20,0 г глюкози, 1,0 см твін-80, 2,0 г калію фосфорнокислого двузамещенного, 5,0 г натрію ацетату , 2,0 г тріаммонія цитрату, 0,2 г сульфату магнію, 0,05 г сульфату марганцю (MnSO · 4НО), доливають до мітки м'ясну воду; розчиняють компоненти нагріванням на водяній бані і встановлюють рН таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (6,2 ± 0,1). Середовище розливають по 10 см в стерильні пробірки і стерилізують в автоклаві при температурі (121 ± 1) ° С протягом 15 хв. Пробірки з живильним середовищем зберігають при температурі (4 ± 1) ° С не більше 30 діб.

3.2.7. Середу МРС щільних готують за рецептурою, зазначеної в п.3.2.6, з додаванням 15-18 г агару. Після розчинення компонентів середу розливають в стерильні колби і стерилізують в автоклаві при температурі (121 ± 1) ° С протягом 15 хв. Готове середовище зберігають при температурі (4 ± 1) ° С не більше 30 діб.

При необхідності, для підвищення селективності, після стерилізації до 1 дм агаризованому або рідкого середовища додають 1 см лужного розчину сорбінової кислоти по п.3.1.8.

3.2.8. Середа м'ясо-пептони бульйон з рН 9,6:

в м'ясо-пептонном бульйоні, приготованому з ГОСТ 10444.1, Встановлюють рН за допомогою розчинів лугу і кислоти по ГОСТ 10444.1таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С 9,6. Середовище стерилізують при температурі (121 ± 1) ° С протягом 20 хв.

3.2.9. Середу м'ясо-пептони бульйон з вмістом хлористого натрію 6,5% готують по ГОСТ 10444.1, Але при приготуванні збільшують кількість доданого хлористого натрію до 65 г на 1 дм середовища.

3.2.10. Середовище живильне агар з сахарозою:

100,0 г сахарози, 15,0 г агару додають в 1 дм м'ясо-пептонного бульйону, періодично перемішуючи, суміш нагрівають до кипіння і повного розчинення всіх компонентів.

Середу охолоджують до 45-55 ° С і встановлюють рН таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (7,1 ± 0,1).

Середовище розливають в колби і стерилізують протягом 15 хв при температурі (121 ± 1) ° С. Після стерилізації і перевірки рН середу добре перемішують і розливають у чашки Петрі, зберігають при температурі (4 ± 1) ° С не більше 14 діб.

3.2.11. Середа Редді: основа середовища - в колбу, що містить 500 см дистильованої води, додають 15,0 г агару і нагрівають на водяній бані до розчинення агару. В іншу колбу, що містить 500 см дистильованої води, додають 10,0 г цитрату калію і 15,0 г карбоксілметілцеллюлози і розчиняють при нагріванні. Вміст обох колб змішують і додають 3,0 г пептона, 25 см дріжджового екстракту, 1,25 г калію фосфорнокислого двузамещенного, 5,0 г L-аргінін гідрохлориду, нагрівають на водяній бані до повного розчинення компонентів, охолоджують до температури 45-55 ° З і встановлюють рН таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (6,3 ± 0,2). Основу середовища стерилізують при температурі (121 ± 1) ° С протягом 15 хв і зберігають при температурі (4 ± 1) ° С не більше 30 діб.

Для приготування живильного середовища до 1 дм розплавленої та охолодженої до 45-55 ° С основи додають 5,0 см стерильного знежиреного молока, 100 см суспензії вуглекислого кальцію масовою концентрацією 30 г / дм і 2 см розчину бромкрезолового пурпурного масовою концентрацією 1 г / дм.

3.2.12. Середа Рогоза рідка: в мірну колбу місткістю 1,0 дм поміщають 10,0 г пептона, 25,0 см дріжджового екстракту, 20,0 г глюкози, 1,0 см твін-80, 6,0 г калію фосфорнокислого однозамещенного, 2, 0 г цитрату амонію, 25,0 г ацетату натрію, 1,32 см крижаної оцтової кислоти, 0,575 г сульфату магнію, 0,12 г сульфату марганцю (MnSO · 2НО), 0,034 г сульфату заліза, доливають до мітки дистильовану воду, розчиняють компоненти нагріванням на водяній бані і встановлюють рН таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (5,4 ± 0,1). Середовище розливають по 10 см в стерильні пробірки і стерилізують в автоклаві при температурі (121 ± 1) ° С протягом 15 хв. Пробірки з живильним середовищем зберігають при температурі (4 ± 1) ° С не більше 30 діб.

3.2.13. Середу Рогоза щільних готують за рецептурою, описаної в п.3.2.12, з додаванням 20,0 г агару. Після розчинення компонентів середу розливають в стерильні колби і стерилізують в автоклаві при температурі (121 ± 1) ° С протягом 15 хв. Готове середовище зберігають при температурі (4 ± 1) ° С не більше 30 діб.

3.2.14. Середу з томатного соку готують по ГОСТ 10444.1.

3.2.15. Середовище для визначення псевдокаталази: в мірну колбу місткістю 1 дм поміщають 5,0 * пептона, 25 см дріжджового екстракту, 0,5 см твін-80, 0,1 г (MnSO · 4НО), 0,5 г глюкози, 15 г агару доливають м'ясо-пептони бульйоном до мітки, розчиняють компоненти нагріванням на водяній бані і встановлюють рН таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (6,9 ± 0,1). Середовище розливають в пробірки по 5-7 см і стерилізують в автоклаві при температурі (121 ± 1) ° С протягом 15 хв. Після стерилізації пробірки укладають на похилу поверхню для отримання косяків.
________________
* Текст документа відповідає оригіналу. - Примітка виробника бази даних.

3.2.16. Середа Lee:

основа середовища - в мірну колбу місткістю 1 дм поміщають 10,0 г пептона, 50 см дріжджового екстракту, 5,0 г лактози, 3,0 г вуглекислого кальцію, простерилізованого по ГОСТ 10444.1, 0,5 г NaHPO, 18 г агару, доливають дистильованою водою до мітки, розчиняють компоненти нагріванням на водяній бані і встановлюють рН таким чином, щоб після стерилізації він становив при 25 ° С (7,0 ± 1). Середовище стерилізують в автоклаві при температурі (121 ± 1) ° С протягом 20 хв і, при необхідності, зберігають при температурі (4 ± 1) ° С не більше 30 діб.

Для приготування живильного середовища до 1 дм основи додають 20 см стерильного розчину бромкрезолового пурпурного з масовою концентрацією 1 г / дм, перемішують і розливають у чашки Петрі. Середу зберігають при температурі (4 ± 1) ° С не більше 7 діб.

3.3.1. Приготування гидролизованного молока

Натуральне або відновлене знежирене молоко кип'ятять або обробляють текучим паром протягом 20 хв і охолоджують до температури (45 ± 2) ° С. Доводять активну кислотність до рН (7,7 ± 0,1), додаючи водний розчин з масовою часткою NaOH 40%. До 1000 см молока додають від 0,5 до 1,0 г порошку панкреатину. Потім до молока додають від 5 до 6 см хлороформу. Колбу закривають корковою пробкою і витримують при температурі (40 ± 2) ° С протягом 18-24 год. Протягом перших 3-5 ч молоко 2-3 рази перемішують (пробку після перемішування відкривають для видалення хлороформу).

Потім гідролізований молокофільтрують через паперовий фільтр, розводять дистильованою водою у співвідношенні 1: 1, встановлюють активну кислотність рН (7,1 ± 0,1), додаючи водний розчин з масовою часткою NaOH 40% і використовують для приготування агару з гідролізованим молоком. У разі зберігання Гідролізований молоко стерилізують в автоклаві при температурі (121 ± 1) ° С протягом 15 хв.

3.3.2. Приготування агару з гідролізованим молоком

склад:


Гідролізований молоко, см

До 1000 см гидролизованного молока додають 15 г агару. Середу нагрівають до повного розплавлення агару і фільтрують через вату, розливають у пробірки або колби і стерилізують в автоклаві при температурі (121 ± 1) ° С протягом (10 ± 1) хв.

3.3.3. Приготування стерильного знежиреного молока

Натуральне або відновлене знежирене молоко розливають по 10 см в пробірки і стерилізують при температурі (121 ± 1) ° С протягом (10 ± 1) хв.

4. ПРОВЕДЕННЯ ВИПРОБУВАННЯ

4.1.1. Для визначення мікроорганізмів використовують підготовлену пробу продукту або його вихідне розведення.

Для визначення присутності і підрахунку кількості мікроорганізмів на чашках Петрі з проби харчового продукту або з вихідного розведення готують ряд розведень відповідно до допустимою кількістю мікроорганізмів, зазначених у нормативно-технічної документації на конкретний вид харчового продукту.

Для підрахунку НВЧ з проби харчового продукту готують вихідне і ряд десятикратних розведень таким чином, щоб в посівах найбільшого розведення мікроорганізми не були виявлені. Для посіву вибирають не менше трьох послідовних розведень. З кожного розведення засівають три паралельні пробірки.

4.1.2. Для посіву в рідкі середовища за методом НВЧ і на чашки Петрі глибинним методом відбирають по 1,0 см підготовленої проби продукту і (або) його розведення, для посіву на чашки Петрі поверхневим методом - по 0,1-0,2 см.

Посіви глибинним або поверхневим методами, а також із застосуванням мембранної фільтрації проводять по ГОСТ 26670.

При застосуванні методу мембранних фільтрів фільтрують обсяг рідкого продукту, який вказаний в нормативно-технічної документації на конкретний вид харчового продукту.

4.1.3. Для визначення присутності або підрахунку НВЧ молочнокислих мікроорганізмів проводять посів на одну з рідких середовищ, зазначених в пп.3.2.2, 3.2.6 або 3.2.12.

Якщо після внесення продукту в середу Блікфельдта середовище змінилося колір, то в неї додають кілька крапель розчину стерильною лугу (NaOH або KOH) масовою концентрацією 50 г / дм до відновлення первинного забарвлення.

Для визначення присутності або підрахунку кількості молочнокислих мікроорганізмів допускається замість посіву в рідкі середовища проводити посів глибинним методом в одну з щільних середовищ, зазначених в пп.3.2.1, 3.2.5, 3.2.7, 3.2.13 або 3.2.14.

Для визначення присутності або підрахунку НВЧ бактерій роду Lactobacillus проводять посів на одну з рідких середовищ, зазначених в пп.3.2.6 або 3.2.12.

Для визначення присутності або підрахунку кількості бактерій роду Lactobacillus замість посіву в рідкі середовища проводять посів глибинним методом в одну з щільних середовищ, зазначених в пп.3.2.7 або 3.2.13.

Для визначення присутності бактерій роду Leuconostoc проводять посів на рідку середу, зазначену в п.3.2.4.

Для визначення присутності замість використання рідкого середовища, а також для підрахунку кількості бактерій роду Leuconostoc на чашках Петрі або із застосуванням методу мембранної фільтрації проводять посів поверхневим методом на щільних середу, зазначену в п.3.2.10.

Для визначення присутності або підрахунку кількості стрептококів групи N роду Streptococcus проводять посів глибинним методом в щільних середу, зазначену в п.3.2.11, а для S.thermophilus використовують середу по п.3.2.16.

Для визначення присутності або підрахунку кількості бактерій роду Pediococcus проводять посів глибинним методом в щільних середу, зазначену в п.3.2.3.

4.1.4. Посіви для визначення присутності або підрахунку кількості молочнокислих мікроорганізмів, бактерій родів Lactobacillus стрептококів групи N роду Streptococcus инкубируют не більше 5 діб при температурі (30 ± 1) ° С або не більше 3 діб при температурі (37 ± 1) ° С; посіви для визначення присутності або підрахунку кількості бактерій роду Leuconostoc инкубируют не більше 5 діб при температурі (22 ± 1) ° С. Посіви для визначення присутності або підрахунку кількості S.thermophilus инкубируют (48 ± 3) ч при температурі (45 ± 1) ° С. Посіви на чашках Петрі для визначення присутності або підрахунку кількості бактерій роду Leuconostoc инкубируют дном вниз.

Інкубування посівів на рідких середовищах припиняють при появі видимих ознак росту.

Попередній підрахунок колоній на щільних середовищах проводять через 48 ч.

4.1.5. У посівах на щільних середовищах для визначення присутності або підрахунку кількості молочнокислих мікроорганізмів, бактерій роду Lactobacillus, Pediococcus стрептококів групи N роду Streptococcus, S.thermophilus, обмеження доступу здійснюють по ГОСТ 30425або одним із зазначених нижче способів:

на застиглу живильне середовище в чашках Петрі наливають другий шар розплавленої та охолодженої до (45 ± 1) ° С агаризованому середовища в кількості 5,0 см і залишають до затвердіння;

чашки Петрі поміщають в газове середовище, що складається з 95% N і 5% СО;

чашки Петрі поміщають в анаеростатах. Апарат закривають, за допомогою вакуумного насоса створюють вакуум 86,6-93,3 кПа;

в кожну пробірку з рідким середовищем додають стерильний рідкий парафін в кількості, необхідній для отримання стовпа висотою близько 2 см.

4.1.6. Посіви на рідких середовищах щодня переглядають і відбирають пробірки з видимими ознаками росту. Характер зростання на рідких середовищах наведено в додатку 2. З пробірок з ознаками росту проводять пересів на щільних середовища (див. П.4.1.3) бактеріологічною петлею так, щоб отримати зростання ізольованих колоній. Посіви інкубують по п.4.1.4.

4.1.7. Посіви на щільних середовищах після інкубування переглядають і для підрахунку відбирають чашки Петрі, на яких виросло від 15 до 150 характерних колоній.

При визначенні кількості мікроорганізмів методом мембранних фільтрів допускається проводити відбір чашок Петрі для підрахунку, якщо на фільтрах виросло менше 15 характерних колоній.

Характеристика характерних колоній приведена в додатку 2.

4.1.8. Для підтвердження належності характерних колоній до молочнокислим мікроорганізмам або бактеріям одного з родів Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus стрептококів групи N роду Streptococcus, S.thermophilus, відбирають з посівів по п.4.1.7 або 4.1.6 не менше 5 характерних колоній. Належність кожної відібраної колонії до певних мікроорганізмів встановлюють по відношенню до фарбування за Грамом, рухливості, наявності каталази, додатково при ідентифікації бактерій роду Leuconostos визначають наявність капсул, при ідентифікації стрептококів виду S.thermophilus і стрептококів групи N роду Streptococcus - наявність зростання в мясопептонном бульйоні з рН 9,6 і в мясопептонном бульйоні з 6,5% NaCl.

4.1.8.3. Каталазну активність культур визначають за ГОСТ 30425.

Результати визначення каталазной активності оцінюють згідно з додатком 1.

Розкладання перекису водню у бактерій роду Pediococcus можливо за рахунок ферменту псевдокаталази. Тому при визначенні молочнокислих мікроорганізмів або бактерій роду Pediococcus в разі, якщо в характерних колоніях виявлено грампозитивні, нерухомі мікроорганізми, що дають позитивну каталазну реакцію, контролюють відсутність цитохромов шляхом постановки бензидинового тесту. Для цього виросли на чашках Петрі колонії бактерій 24-48-годинного віку заливають розчином бензидину, зазначеним в п.3.1.9. Після того, як розчин оживляти колонії, додають в чашку приблизно такий же обсяг 5% -ного перекису водню. Молочнокислі мікроорганізми, в тому числі бактерії роду Pediococcus, не містять цитохромов. У разі присутності цитохромов колонії забарвлюються в блакитно-зелений або яскраво-блакитний колір.

При відсутності бензидина допускається проводити визначення наявності псевдокаталази на середовищі п.3.2.15 з низькою концентрацією глюкози - 0,05%.

Посіви інкубують по п.4.1.4, визначення псевдокаталази проводять так само як і каталази по ГОСТ 30425.

Культури, що утворюють псевдокаталазу, відносять до роду Pediococcus.

4.1.8.4. При ідентифікації бактерій роду Leuconostoc готують препарати і фарбують їх по Бурі для виявлення бактеріальних капсул. Для цього на добре знежиреному і обпеченому предметному склі змішують краплю бактеріальної культури з дрібним порошком чорної туші або суспензією нігрозину.

За допомогою іншого скла з шліфованими краями швидко готують тонкий мазок, який фіксують, кілька разів проводячи його через полум'я пальника. Мазок дофарбовують розчином кристалічного фіолетового або робочим розчином карболфуксіна. Обережно промивають в посудині з водою, залишають на повітрі для висихання і проводять мікроскопію. Не допускається сушити мазок між листами фільтрувального паперу. Фон препарату забарвлюється тонкої суспензією чорної туші або нігрозину. Тіла бактерій фарбуються монохроматично, капсули залишаються незабарвленими.

4.1.8.5. При ідентифікації стрептококів групи N роду Streptococcus, стрептококів виду S.thermophilus визначають відсутність зростання на м'ясо-пептонном бульйоні з рН 9,6 і на м'ясо-пептонном бульйоні з вмістом хлористого натрію 6,5%.

Для цього культури по п.4.1.8 пересівають на середовища, зазначені в пп.3.2.8 і 3.2.9.

Посіви інкубують при температурі (30 ± 1) ° С протягом 3 діб, а при ідентифікації S.thermophilus посіви інкубують при (45 ± 1) ° С протягом 3 діб.

4.2.1. Приготування розведень кисломолочних продуктів (сухих і рідких) по ГОСТ 9225.

Для приготування розведень заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій краю флакона і пакета протирають спиртом, край флакона обпалюють і виймають пробку, край пакета надрізають профламбированное ножицями, відважують 1 г випробуваного матеріалу в стерильну або профламбированное ступку, прикриту кришкою від чашки Петрі або стерильною папером, ретельно розтирають, додаючи невелику кількість розчину хлористого натрію або фосфатного буфера з колби, що містить 99 см розчину або буфера. Суспендованих матеріал переливають в колбу з розчином, що залишився хлористого натрію або фосфатного буфера і здобувають другу розведення 1: 100.

З других розведень кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій готують такі розведення відповідно до кількості молочнокислих бактерій, зазначеним в нормативно-технічної документації, користуючись табл.1.

Таблиця 1


Найменування продукту	Розведення, використовувані для посіву
Кисломолочні напої, закваски рідкі і сухі, сир, сметана	10; 10; 10; 10
Бактеріальні концентрати, бактеріальні препарати молочнокислих бактерій
Сухі кисломолочні продукти

4.2.2. Посів для підрахунку кількості молочнокислих стрептококів проводять в щільних або рідку живильне середовище, приготовлену відповідно до пп.3.3.2 і 3.3.3, а посів для підрахунку кількості молочнокислих паличок - в рідку середу, приготовлену відповідно до п.3.3.3.

Для посіву в щільних живильне середовище вибирають ті розведення, при посіві яких на чашках виростає від 15 до 150 колоній.

З кожної проби роблять посів по ГОСТ 9225 1 см відповідних розведень продукту (див. Табл.1) на чашки Петрі.

При посіві в рідку живильне середовище з трьох-чотирьох останніх розведень (див. Табл.1) вносять по 1 см кожного розведення в дві паралельні пробірки зі стерильним знежиреним молоком.

5. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

5.1.1. Результати аналізу харчового продукту оцінюють по кожній пробі окремо.

5.1.2. Якщо при вивченні культуральних, морфологічних і біохімічних властивостей при визначенні:

молочнокислих мікроорганізмів виявлені грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние палички або неспорообразующие, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние або утворюють псевдокаталазу коки, то дають висновок про те, що виявлені мікроорганізми відносяться до молочнокислим;

бактерій роду Lactobacillus виявлені неспорообразующие, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние палички, то дають висновок про те, що виявлені мікроорганізми відносяться до роду Lactobacillus;

бактерій роду Leuconostoc виявлені неспорообразующие, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние, оточені капсулою коки, то дають висновок про те, що виявлені мікроорганізми відносяться до роду Leuconostoc;

бактерій роду Streptococcus групи N виявлені неспорообразующие, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние, що не дають зростання в поживних середовищах з рН 9,6 і 6,5% NaCl, коки, то дають висновок про те, що виявлені мікроорганізми відносяться до роду Streptococcus групи N;

бактерій роду Pediococcus виявлені неспорообразующие, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние (або каталазоположітельние, але дають негативний бензидинового тест) або псевдокаталазоположітельние коки, то дають висновок про те, що виявлені мікроорганізми відносяться до роду Pediococcus;

бактерій виду S.thermophilus виявлені неспорообразующие, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние, термофільні коки, що не дають зростання в поживних середовищах з рН 9,6 і 6,5% NaCl, то дають висновок про те, що виявлені мікроорганізми відносяться до виду Streptococcus thermophilus.

5.1.5. Найбільш ймовірне число (НВЧ) мікроорганізмів визначають за кількістю позитивних пробірок по ГОСТ 30425.

Якщо десятикратні розведення, вибрані для посіву, були вищими, наприклад 10, 10 і 10, то табличне значення НВЧ множать на різницю між обраними і табличними десятикратними разведениями, тобто на 100.

Якщо десятикратні розведення, вибрані для посіву, були нижчими, наприклад 10 (1 г), 10, 10, то табличне значення НВЧ ділять на різницю між обраними і табличними десятикратними разведениями, тобто на 10.

5.1.6. Результати визначення кількості мікроорганізмів методом посіву в чашки Петрі або методом НВЧ або із застосуванням методу мембранної фільтрації перераховують на 1 г або 1 см продукту і записують відповідно до вимог ГОСТ 26670.

5.2. Обробка результатів аналізу кисломолочних продуктів, заквасок, бактеріальних концентратів і бактеріальних препаратів молочнокислих бактерій

5.2.1. При розвитку молочнокислих бактерій на рідкому середовищі-молоці - молоко згортається.

Для підрахунку загальної кількості молочнокислих бактерій (стрептококів і паличок) відзначають три останніх розведення, в яких молоко згорнулося.

Складають числову характеристику. Вона складається з трьох цифр, що вказують в трьох останніх розведеннях. Перша цифра числової характеристики відповідає тому розведення, при якому в двох пробірках молоко згорнулося. Наступні цифри позначають число пробірок зі зсілим молоком в двох наступних розведеннях.

За числовий характеристиці по табл.2 знаходять найбільш ймовірне число молочнокислих мікроорганізмів, яке множать на те розведення, з якого починається перша цифра числової характеристики.

Таблиця 2


числова характеристика	Найбільш ймовірне число мікроорганізмів при зараженні двох паралельних пробірок

Не включені неприйнятні комбінації.

Отримане число відповідає кількості клітин молочнокислих бактерій в 1 г або 1 см продукту.

Приклад розрахунку найбільш ймовірного числа мікроорганізмів при зараженні двох паралельних пробірок наведено в додатку 3.

Якщо необхідно визначити диференційовано кількість стрептококів і паличок, то з пробірок, в яких молоко згорнулося, роблять мікроскопічний препарат по ГОСТ 9225, Переглядають його і окремо відзначають пробірки, в яких є палички і стрептококи.

Підрахунок кількості молочнокислих стрептококів або паличок проводять, як зазначено вище.

5.2.2. Підрахунок кількості колоній, що виросли молочнокислих бактерій на агаризованому середовищі і перерахунок їх змісту в 1 г або 1 см продукту проводять по ГОСТ 9225.

Додаток 1 (довідковий). ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

ДОДАТОК 1
довідкове


Найменування мікроорганізмів	характеристика
Молочнокислі мікроорганізми (за винятком роду Sporolactobacillus ідентифікованого по ГОСТ 30425)	Неспороутворюючих, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние палички або неспорообразующие, грампозитивні, нерухомі, каталазоотріцательние або утворюють псевдокаталазу коки
Бактерії роду Lactobacillus	Грампозитивні, неспорообразующие короткі або довгі, нерухомі, каталазоотріцательние палички
Слизеобразующие бактерії роду Leuconostoc	Грампозитивні, неспорообразующие, що мають сферичну або овальну форму, розташовані попарно або в ланцюжках, оточені капсулою, яка по Граму не фарбується, нерухомі каталазоотріцательние коки
Стрептококи групи N роду Streptococcus	Грампозитивні, неспорообразующие, які розташовуються у вигляді коротких і довгих ланцюжків, нерухомі, каталазоотріцательние, що не дають зростання в поживних середовищах з рН 9,6 і 6,5% NaCl коки
Бактерії роду Pediococcus	Грампозитивні, неспорообразующие, розташовані парами і тетрадами, нерухомі, каталазоотріцательние або утворюють псевдокаталазу коки
Стрептококи виду S.thermophilus	Грампозитивні, розташовані парами або у вигляді коротких або довгих ланцюжків, нерухомі, каталазоотріцательние, термофільні, що не дають зростання в поживних середовищах з рН 9,6 і 6,5% NaCl коки

Додаток 2 (довідковий). ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛОНІЙ молочнокислих мікроорганізмів щільних І ХАРАКТЕР ЗРОСТАННЯ НА РІДКИХ СЕРЕДОВИЩАХ

ДОДАТОК 2
довідкове


мікроорганізми	Живильне середовище	Характеристика колоній або характер росту на рідкому середовищі
молочнокислі мікроорганізми	Блікфельдта рідка	Зміна кольору середовища від фіолетового до жовтого, помутніння середовища або утворення осаду, можливе виділення газу
	Блікфельдта щільних, середа з томатного соку	Колонії дрібні гладкі або шорсткі
	капустяний агар	Колонії оточені прозорою зоною
Молочнокислі бактерії роду Lactobacillus або молочнокислі мікроорганізми	Рогоза і МРС щільних	Колонії безбарвні діаметром від 1 до 3 мм лінзоподібної або зіркоподібною форми
	Рогоза і МРС рідкі	помутніння середовища
Молочнокислі бактерії роду Leuconostoc	Агар поживний з сахарозою	Колонії опуклі, округлі, слизові. При видаленні колоній голкою або бактеріологічною петлею виявляються волокна слизу
Молочнокислі бактерії роду Streptococcus групи N		S.lactis утворює колонії білі, дрібні, круглі, навколо колоній можуть бути зони просвітління
		S.cremoris колонії дрібні, жовті, елліпсовідниє
Молочнокислі бактерії роду Pediococcus	Середа Брігс в модифікації Шарп	Колонії дрібні, гладкі або шорсткі
Молочнокислі стрептококи виду S.thermophilus		Колонії жовті, круглі або елліпсовідниє, навколо яких спостерігаються зони просвітління

Додаток 3 (обов'язковий). ПРИКЛАД РОЗРАХУНКУ ймовірного числа молочнокислих бактерій методом ГРАНИЧНИХ розведення

Додаток 3
довідкове


Приклад 1.
взяті розведення
Число пробірок з посівами
Число пробірок зі зсілим молоком

Складають числову характеристику. Вона складається з трьох цифр, що вказують число пробірок зі зсілим знежиреним молоком в трьох останніх розведеннях. Перша цифра (зліва) числової характеристики - 2 (згорнулися 2 пробірки розведення 1: 100), друга - 1 і третя - 1.

Отже, числова характеристика буде 211. Вона відповідає за табл.2 числу 13,0. Це число треба помножити на те розведення, з якого починалася перша цифра числової характеристики (в прикладі це розведення дорівнює 1: 100).

Таким чином в 1 см міститься 1300 молочнокислих бактерій (13,0x100 = 1300).


Приклад 2.
взяті розведення
Число пробірок з посівами
Число пробірок зі зсілим молоком
Стрептококи виявлені в мікроскопічних препаратах наступних розведень
Молочнокислі палички виявлені в мікроскопічних препаратах наступних розведень
Числова характеристика дорівнює для: стрептококів

Ймовірне число мікробів одно для стрептококів

Помноживши на розведення, отримуємо кількість стрептококів в 1 см - 7000, паличок - 250.

Електронний текст документа
підготовлений АТ "Кодекс" і звірений по:
офіційне видання
Продукти харчові, консерви.
Методи мікробіологічного аналізу:
Зб. ГОСТів. - М .: Стандартинформ 2010